熒光分析和成像技術(shù)因具有非常高的靈敏度和分子特異性而普遍的應(yīng)用于生物物理、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理、化學(xué)等領(lǐng)域，利用熒光光譜技術(shù)和熒光顯微技術(shù)可以分析樣品中熒光團(tuán)的組分和分布。不過(guò)，由于熒光分析技術(shù)大多是基于熒光強(qiáng)度的測(cè)量，容易受到激發(fā)光強(qiáng)度、樣品濃度淬滅、熒光染料的分布濃度等因素的影響。熒光壽命通常來(lái)講是一定的，不受激發(fā)光強(qiáng)度、熒光團(tuán)濃度等因素的影響，只只與熒光團(tuán)所處的微環(huán)境有關(guān)，因此，利用熒光壽命顯微鏡（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）對(duì)樣品進(jìn)行熒光壽命成像，可以對(duì)樣品所在的微環(huán)境中的許多物理參數(shù)如氧壓、溶液疏水性等及生物化學(xué)參數(shù)如pH值、離子濃度等進(jìn)行定量測(cè)量。此外，熒光壽命成像技術(shù)還可以同時(shí)獲得分子狀態(tài)和空間分布的信息。熒光壽命成像基于熒光團(tuán)的熒光壽命取決于其分子環(huán)境而并非濃度的事實(shí)。浙江生物熒光壽命成像哪家實(shí)惠

門控探測(cè)法適用于單組分熒光強(qiáng)度衰減的測(cè)量和熒光壽命成像。熒光壽命可通過(guò)在兩個(gè)不同延遲時(shí)刻開(kāi)啟的相同寬度的門內(nèi)記錄的熒光強(qiáng)度信息求得，通常情形下，在條件允許的情況下，采用多門控探測(cè)，即選取多個(gè)窗口獲取多幅圖像（通常為5~10幅）來(lái)反演壽命圖像。一般使用門控微通道板像增強(qiáng)器（MCP Intensifier）或者增強(qiáng)型CCD（Intensified CCD）相機(jī)，實(shí)現(xiàn)樣品的寬場(chǎng)（full-field）熒光壽命成像。通過(guò)在樣品受到超短光脈沖激發(fā)后的不同時(shí)刻（時(shí)間窗口）選通像增強(qiáng)器或CCD相機(jī)，獲得一組熒光強(qiáng)度圖像，然后利用公式，逐點(diǎn)計(jì)算出樣品上各點(diǎn)的熒光壽命并成像。浙江生物熒光壽命成像哪家實(shí)惠熒光壽命顯微成像是熒光壽命測(cè)量和熒光顯微技術(shù)的結(jié)合。

在基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)的熒光壽命成像實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)選用超快激光器可以優(yōu)化脈沖持續(xù)時(shí)間，單光子探測(cè)器和時(shí)間數(shù)字轉(zhuǎn)換器的時(shí)間抖動(dòng)則成為制約時(shí)間分辨率的關(guān)鍵參數(shù)。熒光壽命成像可進(jìn)行高質(zhì)量的多色成像實(shí)驗(yàn)或?qū)崿F(xiàn)STED、PALM/STORM等超分辨率熒光顯微成像。目前TCSPC是主要應(yīng)用的熒光壽命測(cè)定技術(shù)。熒光壽命通常在ps～us量級(jí)，在如此短的時(shí)間量級(jí)上進(jìn)行測(cè)量，它是較為成熟準(zhǔn)確的測(cè)試手段。TCSPC的工作原理是使用一個(gè)同步信號(hào)源驅(qū)動(dòng)激光器，出射光脈沖照射樣品池，在利用光子探測(cè)裝置（多為PMT）對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行探測(cè)，每一個(gè)光子計(jì)數(shù)信號(hào)在FT1010中都會(huì)落入一個(gè)對(duì)應(yīng)的時(shí)間窗口，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的統(tǒng)計(jì)疊加后即得到熒光壽命曲線。幾十萬(wàn)次重復(fù)以后，不同的時(shí)間通道累積下來(lái)的光子數(shù)目不同。

熒光壽命成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)控納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性：利用熒光壽命成像顯微鏡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)可以實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)光納米顆粒在活細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。熒光壽命成像不但具有其它熒光顯微鏡所具有的高靈敏度、可檢測(cè)人體生物樣品等優(yōu)點(diǎn)，它在監(jiān)控?zé)晒饧{米材料的穩(wěn)定性上還具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）熒光壽命不受熒光探針的濃度的影響，可排除納米材料的胞吐及細(xì)胞分化導(dǎo)致的納米顆粒的稀釋等對(duì)測(cè)量的影響；（2）很多常見(jiàn)的發(fā)光材料的熒光壽命都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞的自熒光的壽命，很易去除生物自熒光對(duì)熒光成像的干擾；（3）發(fā)光材料的熒光壽命和其材料的穩(wěn)定性密切相關(guān)，熒光壽命的改變可以靈敏地反映相應(yīng)材料的化學(xué)穩(wěn)定性。熒光壽命成像(FLIM)可用于測(cè)量分子環(huán)境參數(shù)。

新技術(shù)和新概念的發(fā)展促進(jìn)了數(shù)據(jù)評(píng)估，意味著熒光壽命成像(FLIM)的速度提高了10倍，可以媲美標(biāo)準(zhǔn)共聚焦成像，且操作簡(jiǎn)單。熒光過(guò)程提供了兩個(gè)用于成像的測(cè)量參數(shù)：強(qiáng)度和熒光壽命。熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間。可以通過(guò)觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集中來(lái)測(cè)量熒光染料的典型壽命。我們可以測(cè)量圖像中所有像素的典型壽命，并將這些數(shù)字記入數(shù)組元素。那就是熒光壽命成像。典型的熒光壽命范圍在0.2到20納秒之間。熒光壽命與熒光染料的濃度無(wú)關(guān)。無(wú)論樣品結(jié)構(gòu)只有零星熒光染料還是載滿熒光染料：壽命信號(hào)始終相同，并表明在同一環(huán)境中存在相同的熒光染料。因此，熒光壽命不受光漂白的影響。樣品深處的圖像將比表面圖像暗得多——但壽命并沒(méi)有改變。這是壽命測(cè)定的主要優(yōu)勢(shì)。熒光壽命成像可以提供熒光強(qiáng)度（光子數(shù)）和光子壽命的空間分布。佛山熒光壽命成像批發(fā)

熒光壽命成像主要應(yīng)用領(lǐng)域包括：用于樣品分離。浙江生物熒光壽命成像哪家實(shí)惠

在使用TCSPC測(cè)量熒光壽命的過(guò)程中，需要調(diào)節(jié)樣品的熒光強(qiáng)度，確保每次激發(fā)后較多只有一個(gè)熒光光子到達(dá)終止光電倍增管。TCSPC方法的突出優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、系統(tǒng)誤差小。采用該技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行熒光壽命成像時(shí)，必須逐點(diǎn)測(cè)量樣品的熒光壽命，而每一點(diǎn)的測(cè)量時(shí)間又比較長(zhǎng)，因此，通常認(rèn)為該技術(shù)不太適合熒光壽命測(cè)量。不過(guò)，近年來(lái)，隨著TCSPC技術(shù)和固體超快激光技術(shù)的發(fā)展，TCSPC技術(shù)已具備快速測(cè)量熒光壽命的條件。通過(guò)與激光共聚焦顯微鏡的結(jié)合，可以對(duì)樣品進(jìn)行熒光壽命成像的測(cè)量。浙江生物熒光壽命成像哪家實(shí)惠

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