易操作原代細(xì)胞和細(xì)胞系的比較3.原代細(xì)胞的應(yīng)用由于原代細(xì)胞生物學(xué)特性未發(fā)生很大改變，接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，因此是：(1)研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的工具；(2)更好實(shí)現(xiàn)醫(yī)療的診治模式，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的目的。第二部分：原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)原代培養(yǎng)的原理將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶/膠原酶)、螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱原代培養(yǎng)。主要包括取材——分離——培養(yǎng)等3部分；在原代細(xì)胞應(yīng)用較多的包括：組織（如實(shí)體瘤、皮膚等）、懸浮細(xì)胞的取材等。下面依次介紹：一、組織的取材病人自體的原代細(xì)胞由于更接近臨床患者標(biāo)本，可以更好實(shí)現(xiàn)醫(yī)療的診治模式，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的目的。所以對(duì)病人自體細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)十分必要?；具^(guò)程如下圖所示：原代細(xì)胞的分離步驟備注：上圖細(xì)胞為肉瘤患者的原代細(xì)胞具體步驟如下：1.在無(wú)菌條件下的冰上對(duì)新鮮離體的組織，剔除包膜及壞死組織，無(wú)菌PBS清洗3-5次；切成約1mm3組織塊；2.加入2mmol的EDTA，搖勻后放置冰上約30-60min；3.離心，并加入膠原酶消化（含蛋白酶）；4.消化期間。SD大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，Rat Aortic vascular smooth muscle cells 貨號(hào)：PC-R-18302。黑龍江豚鼠原代細(xì)胞技術(shù)

    本發(fā)明采用活塞式推進(jìn)桿外加正壓式肝素帽設(shè)計(jì)，增強(qiáng)了瓶身的一體性，減少了污染的可能性，且通過(guò)注射器注水的方式可以自行控制纖維板和培養(yǎng)瓶底部的接觸程度，使得操作流程更可控。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明的縱向剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中標(biāo)記為：1-外接圓柱；2-正壓口；3-阻隔環(huán)；4-彈簧；5-連接桿；6-加樣口；7-爬片瓶頸；8-纖維板；9-瓶底；10-直角三角支架；11-活動(dòng)圓盤(pán)；12-纖維圓盤(pán)；13-瓶身。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。如圖1和2所示，一種一體式原代細(xì)胞爬片培養(yǎng)瓶，包括瓶身13，所述瓶身13的其中一側(cè)端部設(shè)有爬片瓶頸7和加樣口6，瓶身13的上端部設(shè)有外接圓柱，所述外接圓柱1的頂端封閉、下端與瓶身13連通，并且外接圓柱1內(nèi)設(shè)有活動(dòng)圓盤(pán)11和纖維圓盤(pán)12，所述活動(dòng)圓盤(pán)11位于纖維圓盤(pán)12的上方，活動(dòng)圓盤(pán)11的四周外壁與外接圓柱1的內(nèi)壁可滑動(dòng)接觸，并且在外接圓柱1內(nèi)壁上設(shè)有用于限制活動(dòng)圓盤(pán)11向上活動(dòng)的阻隔環(huán)3，同時(shí)在外接圓柱1位于活動(dòng)圓盤(pán)11上方的柱體上設(shè)有正壓口2，所述纖維圓盤(pán)12固定設(shè)置，并且在纖維圓盤(pán)12內(nèi)可活動(dòng)穿插有連接桿5，所述連接桿5上端與活動(dòng)圓盤(pán)11固定連接。黑龍江豚鼠原代細(xì)胞構(gòu)建自我更新能力和多向分化能力是干細(xì)胞的兩個(gè)基本特征。

    且方便標(biāo)號(hào)對(duì)比。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本實(shí)用新型的一個(gè)方面，本實(shí)用新型提供了如下技術(shù)方案：一種可以分離的細(xì)胞培養(yǎng)板，其包括底座、一號(hào)培養(yǎng)板、二號(hào)培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿槽和橫向標(biāo)尺，所述底座頂部固定安裝有一號(hào)培養(yǎng)板，所述一號(hào)培養(yǎng)板頂部設(shè)置有梯形卡槽，所述一號(hào)培養(yǎng)板頂部設(shè)置有二號(hào)培養(yǎng)板，所述二號(hào)培養(yǎng)板底部固定安裝有與梯形卡槽相配合的梯形卡塊。作為本實(shí)用新型所述的一種可以分離的細(xì)胞培養(yǎng)板的一種方案，其中：所述一號(hào)培養(yǎng)板和所述二號(hào)培養(yǎng)板表面設(shè)置有培養(yǎng)皿槽，所述培養(yǎng)皿槽內(nèi)腔側(cè)壁設(shè)置有限位槽，所述限位槽內(nèi)腔固定安裝有限位彈簧，所述限位彈簧頂部貫穿限位槽設(shè)置有固定桿。作為本實(shí)用新型所述的一種可以分離的細(xì)胞培養(yǎng)板的一種方案，其中：所述一號(hào)培養(yǎng)板和二號(hào)培養(yǎng)板的前表面左側(cè)設(shè)置有縱向標(biāo)尺，所述一號(hào)培養(yǎng)板和二號(hào)培養(yǎng)板的前表面左側(cè)設(shè)置有橫向標(biāo)尺，所述一號(hào)培養(yǎng)板和所述二號(hào)培養(yǎng)板的頂部設(shè)置有防護(hù)蓋。作為本實(shí)用新型所述的一種可以分離的細(xì)胞培養(yǎng)板的一種方案，其中：所述梯形卡槽的前表面固定安裝有固定螺絲，所述梯形卡塊上設(shè)置有相配合的螺孔，所述梯形卡槽內(nèi)腔底部設(shè)置有滑槽，梯形卡塊底部設(shè)置有與滑槽相配合的滑塊。

    凍存過(guò)程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。[4]細(xì)胞培養(yǎng)具體步驟編輯一、細(xì)胞復(fù)蘇將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移入15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10mlDMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤(pán)中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二、細(xì)胞傳代細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mlPBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×105/盤(pán)接種，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。三、細(xì)胞凍存細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。加入1ml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染（Transfection）是指將DNA或者RNA導(dǎo)入真核細(xì)胞中的過(guò)程。

    下端伸入瓶身并與設(shè)于瓶身內(nèi)的纖維板固定連接，并且在活動(dòng)圓盤(pán)和纖維圓盤(pán)之間的連接桿上套裝有彈簧。進(jìn)一步的，所述活動(dòng)圓盤(pán)的四周設(shè)有密封圈。進(jìn)一步的，所述彈簧處于自然狀態(tài)或輕微壓縮狀態(tài)時(shí)，活動(dòng)圓盤(pán)與阻隔環(huán)相接觸。進(jìn)一步的，所述纖維板采用具有阻隔和透氣特性的柔性網(wǎng)格纖維材料制作。進(jìn)一步的，所述外接圓柱的直徑為2cm，所述正壓口的直徑為5mm，并可采用肝素帽封閉。進(jìn)一步的，所述活動(dòng)圓盤(pán)和纖維圓盤(pán)的直徑為。進(jìn)一步的，所述加樣口為直徑，該開(kāi)口可通過(guò)螺紋連接透氣瓶蓋。進(jìn)一步的，所述瓶身底部的四個(gè)角設(shè)置有8個(gè)直角三角支架。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明可以根據(jù)所要爬片的組織塊大小和數(shù)量提供25cm2和75cm2兩種不同規(guī)格長(zhǎng)方體瓶身供爬片，能提高爬片的效率。本發(fā)明采用一體式設(shè)計(jì)，減少了原代細(xì)胞提取過(guò)程中易發(fā)生的污染的可能性，另外一體式設(shè)計(jì)也減少了新手或不熟練操作流程實(shí)驗(yàn)員的時(shí)間成本和器材消耗。本發(fā)明巧妙的利用纖維網(wǎng)格板，一方面網(wǎng)格板的材質(zhì)是柔性的，不易因形變而碎裂，另一方面不僅可以固定組織塊，網(wǎng)格設(shè)計(jì)還可以讓培養(yǎng)基滲入，可謂一舉兩得，且網(wǎng)格板孔徑大小可以定制，滿足不同受眾的要求。產(chǎn)品名稱：人臍間充質(zhì)干細(xì)胞，Human Umbilical cord mesenchymal stem Cells 貨號(hào)：PC-H-18105。西藏模式原代細(xì)胞構(gòu)建

在進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常選用的細(xì)胞模型為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。黑龍江豚鼠原代細(xì)胞技術(shù)

    細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入生存環(huán)境的變化過(guò)程。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用，會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。3）盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3、懸浮型原代細(xì)胞1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。黑龍江豚鼠原代細(xì)胞技術(shù)