反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,也可寫成逆轉(zhuǎn)錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3'-OH末端上，根據(jù)堿基配對的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA，CDNA)。反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。高效的逆轉(zhuǎn)錄體系可提高反應(yīng)效率和檢測靈敏度。鹽城彩色逆轉(zhuǎn)錄混合

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項，隨機引物：適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，首先鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（<500bp）的增加和長片斷、全長產(chǎn)物產(chǎn)物的降低。酵母菌逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一個重要表示，逆轉(zhuǎn)錄在研究RNA表達調(diào)控等領(lǐng)域有普遍的應(yīng)用前景。徐州快速逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄過程是病毒的復(fù)制形式之一，如RNA病毒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（Reversetranscription-PCR，RT-PCR），是以RNA為材料應(yīng)用于PCR擴增中的一種實驗方法。首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA或信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）。其次TaqDNA聚合酶以cDNA為模板進行qPCR擴增。RT-PCR已被普遍應(yīng)用于多種分子生物學(xué)應(yīng)用中，包括基因表達分析、基因測試、RNA干擾驗證檢測、微陣列驗證、病原體檢測和疾病研究。RT-PCR的方法之一步法和兩步法：RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，分成兩步進行。

RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：去除基因組DNA污染：殘留的基因組DNA(gDNA)會對熒光定量結(jié)果造成很大的干擾，為了使結(jié)果更加的真實、可重復(fù)，我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計時避免gDNA的擴增，比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上；或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后，我們還有非常法寶，選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性：逆轉(zhuǎn)錄酶在整個反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少RNA的二級結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”，高于37℃時，穩(wěn)定性大幅下降。逆轉(zhuǎn)錄實驗中引物設(shè)計時要注意反向引物特異性和長度，避免循環(huán)擴增和特異性問題。

多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(cDNalibrary)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中較常用的獲得目的基因的方法。逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。徐州快速逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物中，RNA同樣兼有遺傳信息傳遞和表達功能。鹽城彩色逆轉(zhuǎn)錄混合

反轉(zhuǎn)錄酶的選擇：反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR，理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的RNA，并確保在整個反應(yīng)過程中的全部活性，從而得到質(zhì)量更高的cDNA。鹽城彩色逆轉(zhuǎn)錄混合