miRNA逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)法：首先需要進(jìn)行RNA樣品制備，可選的方法有：離心柱法抽提（不必去除gDNA）；傳統(tǒng)Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分別設(shè)計(jì)。是否采用通用引物視情況而定，正向引物與通用反向引物不會(huì)形成二聚體時(shí)才能用。取200ul的PCR管，根據(jù)所得每組RNA的濃度C，每孔加入1000ng總RNA，按公式1000ng/C計(jì)算出所需RNA的體積x。然后按建議的20μL反應(yīng)體系說(shuō)明，依次向200μL的PCR管內(nèi)加入下列試劑：加樣結(jié)束后，移液器吹打混勻，低速離心數(shù)秒。將逆轉(zhuǎn)錄PCR管放入PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，調(diào)整參數(shù)：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），4℃∞。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行熒光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。說(shuō)明：此處可以選擇U6下游引物作為U6的逆轉(zhuǎn)錄引物，注意相應(yīng)地調(diào)整無(wú)酶水的體積和反應(yīng)溫度。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的缺陷會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤擴(kuò)增和偏差。北京加尾法逆轉(zhuǎn)錄酶報(bào)價(jià)

逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)有重要的理論意義和實(shí)踐意義。（1）在致死病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了病基因，在人類(lèi)一些病細(xì)胞如膀胱病、小細(xì)胞肺病等細(xì)胞中，也分離出與病毒病基因相同的堿基序列，稱(chēng)為細(xì)胞病基因或原病基因。病基因的發(fā)現(xiàn)為疙瘩發(fā)病機(jī)理的研究提供了很有前途的線(xiàn)索。（2）在實(shí)際工作中有助于基因工程的實(shí)施。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備，可將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成DNA用以獲得目的基因。逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：RNA提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；RNA提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的RNA很容易降解；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程，需建立無(wú)RNAase環(huán)境，以避免模板RNA降解。RNase是RNA水解酶的統(tǒng)稱(chēng)，包含RNaseA，RNaseH等，RNaseA可以水解單雙鏈RNA，RNaseH主要水解RNA與DNA雜交雙鏈中的RNA。北京加尾法逆轉(zhuǎn)錄酶報(bào)價(jià)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物中，RNA同樣兼有遺傳信息傳遞和表達(dá)功能。

莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄是一種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的技術(shù)，它利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子作為反向引物，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)RNA分子。該技術(shù)在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中得到了普遍的應(yīng)用，特別是在RNA的研究和檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)的基本原理是利用逆轉(zhuǎn)錄酶和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA作為反向引物，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子具有較高的穩(wěn)定性和特異性，可以特異性地識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)RNA分子，從而在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中作為反向引物擴(kuò)增目標(biāo)cDNA。此外，由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子與目標(biāo)RNA分子的堿基序列互補(bǔ)，因此莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以避免隨機(jī)引物引起的非特異擴(kuò)增。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟：用SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT（20ul體積）1、準(zhǔn)備0、65ml的EP管。2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暫離心。3、65℃水浴5分鐘后，立刻0℃冰水浴至少1分鐘。4、短暫離心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAseInhibitor，1ulSSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶。5、短暫離心。6、50℃水浴60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。7、70℃水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。8、－20℃保存，或立即進(jìn)行PCR。MCERTmix含有比例優(yōu)化的Oligo(dT)和RandomPrimers，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始，并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率，較大程度保證qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。逆轉(zhuǎn)錄是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA的生物化學(xué)過(guò)程。

逆轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動(dòng)作用，它已成為一種重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補(bǔ)的cDNA，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary），從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中較常用的獲得目的基因的方法。簡(jiǎn)要過(guò)程表示：逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的cDNA單鏈，它與RNA模板形成RNA-cDNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過(guò)程。病毒復(fù)制方式：逆轉(zhuǎn)錄病毒（屬于RNA病毒）：RNA→DNA→RNA。擬逆轉(zhuǎn)錄病毒（屬于DNA病毒）：DNA→RNA→DNA。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)qPCR檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效果。上海miQP2反轉(zhuǎn)錄純度高

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)前應(yīng)將各反應(yīng)試劑混勻，避免試劑沉淀或剪切。北京加尾法逆轉(zhuǎn)錄酶報(bào)價(jià)

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng)，引物的選擇，OligodT：選擇OligodT時(shí)，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，較好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。特異性引物：特異性引物只能用你設(shè)計(jì)引物時(shí)的下游引物做RT，引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果，而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以按照說(shuō)明書(shū)按照一個(gè)溫度做不是較佳選擇，一般不推薦。北京加尾法逆轉(zhuǎn)錄酶報(bào)價(jià)