RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：RNA定量：除了掌握RNA的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對(duì)RNA濃度進(jìn)行測(cè)定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會(huì)對(duì)上樣量有要求，建議totalRNA上樣量小于5μg。超過這個(gè)范圍，會(huì)使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性(表達(dá)豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄)而造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇：逆轉(zhuǎn)錄引物一般包含3種：oligodT引物，隨機(jī)引物和特異性引物。對(duì)于短的且不具備發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可用。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。逆轉(zhuǎn)錄過程是病毒的復(fù)制形式之一，如RNA病毒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒。武漢一步法反轉(zhuǎn)錄測(cè)序

逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)有重要的理論意義和實(shí)踐意義。對(duì)分子生物學(xué)的中心法則進(jìn)行了修正和補(bǔ)充。經(jīng)典的中心法則認(rèn)為：DNA的功能兼有遺傳信息的傳遞和表達(dá)，因此，DNA處于生命活動(dòng)的中心位置。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物中，RNA同樣兼有遺傳信息傳遞和表達(dá)功能。修正后的中心法則表示為：是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。某些病毒中的RNA自我復(fù)制和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過程（某些致死病毒）。有些亞病毒例如朊病毒，這種亞病毒沒有核酸，是一種因錯(cuò)誤折疊而形成的結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)直接形成蛋白質(zhì)，可促使與自身具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)發(fā)生同樣的折疊錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致大量結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)的形成。當(dāng)然，一般不認(rèn)為亞病毒屬于生物。杭州莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄過程的揭示是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對(duì)中心法則的重要修正和補(bǔ)充。

RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：去除基因組DNA污染：殘留的基因組DNA(gDNA)會(huì)對(duì)熒光定量結(jié)果造成很大的干擾，為了使結(jié)果更加的真實(shí)、可重復(fù)，我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)避免gDNA的擴(kuò)增，比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上；或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后，我們還有非常法寶，選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性：逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”，高于37℃時(shí)，穩(wěn)定性大幅下降。

逆轉(zhuǎn)錄的端粒復(fù)制：逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)常與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，艾滋、乙肝等很多疾病也有逆轉(zhuǎn)錄過程。所以相關(guān)研究可以為很多疾病的研究和防治提供幫助。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑就一直是藥物研發(fā)熱點(diǎn)，例如抗HIV的nevirapine。逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對(duì)（3'-5'核酸外切酶）功能，所以容易出錯(cuò)。這也是很多病毒容易突變進(jìn)化的原因，比如nevirapine就很容易被抵抗。不過，校對(duì)功能與逆轉(zhuǎn)錄活性并不矛盾。有人使用改良的定向進(jìn)化策略從具有校對(duì)功能的DNA聚合酶（古細(xì)菌的DNA聚合酶B）進(jìn)化出高保真的耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶，稱為逆轉(zhuǎn)錄異種聚合酶（reversetranscriptionxenopolymerase），證明校對(duì)與逆轉(zhuǎn)錄是兼容的。在科研中，RTX可用于RT-PCR等過程，能夠提高精確度及簡(jiǎn)化操作程序。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉(zhuǎn)錄酶的選擇。

反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,也可寫成逆轉(zhuǎn)錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3'-OH末端上，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，CDNA)。反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。武漢一步法反轉(zhuǎn)錄測(cè)序

逆轉(zhuǎn)錄是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA的生物化學(xué)過程。武漢一步法反轉(zhuǎn)錄測(cè)序

miRNA逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)法：首先需要進(jìn)行RNA樣品制備，可選的方法有：離心柱法抽提（不必去除gDNA）；傳統(tǒng)Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分別設(shè)計(jì)。是否采用通用引物視情況而定，正向引物與通用反向引物不會(huì)形成二聚體時(shí)才能用。取200ul的PCR管，根據(jù)所得每組RNA的濃度C，每孔加入1000ng總RNA，按公式1000ng/C計(jì)算出所需RNA的體積x。然后按建議的20μL反應(yīng)體系說明，依次向200μL的PCR管內(nèi)加入下列試劑：加樣結(jié)束后，移液器吹打混勻，低速離心數(shù)秒。將逆轉(zhuǎn)錄PCR管放入PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，調(diào)整參數(shù)：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），4℃∞。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行熒光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。說明：此處可以選擇U6下游引物作為U6的逆轉(zhuǎn)錄引物，注意相應(yīng)地調(diào)整無酶水的體積和反應(yīng)溫度。武漢一步法反轉(zhuǎn)錄測(cè)序