逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟：引物濃度計(jì)算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）。用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT（10ul體積）1、準(zhǔn)備0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA。3、稍離心，100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉(zhuǎn)錄酶。5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min滅活A(yù)MV。7、立即PCR或－20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)注意事項(xiàng)：為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。逆轉(zhuǎn)錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補(bǔ)的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。成都cDNA合成反轉(zhuǎn)錄蛋白檢測(cè)

miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄：miRNA，即microRNA，是一類非常短的RNA分子，只有幾十到幾百個(gè)核首酸，在正常細(xì)胞存活期間會(huì)產(chǎn)生大量的miRNA。miRNA起著重要的抑制作用，它可以抑制特定mRNA的表達(dá)以及細(xì)胞中內(nèi)含物翻譯和轉(zhuǎn)錄等功能他們是催化機(jī)制，負(fù)責(zé)影響細(xì)胞及其產(chǎn)物的生物學(xué)復(fù)雜性和穩(wěn)定性，對(duì)于宿主機(jī)體影響是非常重要的。miRNA加尾法是一種獲得miRNA及其前體的研究方法之。較重要的是，它是RNA千擾技術(shù)的一個(gè)重要組成部分。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)miRNA加尾法獲得的新miRNA表達(dá)調(diào)節(jié)了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡等多重信號(hào)傳遞通路，其過(guò)程非常復(fù)雜。成都cDNA合成反轉(zhuǎn)錄蛋白檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量，過(guò)少或質(zhì)量不佳將影響擴(kuò)增效果。

miRNA的加尾法逆轉(zhuǎn)錄和qPCR，miRNA與mRNA的在qRT-PCR過(guò)程有所不同。一般來(lái)講，mRNA比較長(zhǎng)，其長(zhǎng)度通常在幾百至幾千個(gè)核苷酸，因此使用隨機(jī)引物(RandomPrimerp(dN)6)即可隨機(jī)結(jié)合到mRNA的各位置進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。由于qPCR的過(guò)程只需擴(kuò)增目的片段的一部分(80~200bp)，因此使用隨機(jī)引物的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物盡管不完整，也完全能夠滿足qPCR的需求。當(dāng)然，也可以使用OligodT引物統(tǒng)一從mRNA的ployA尾巴開(kāi)始逆轉(zhuǎn)錄。這種逆轉(zhuǎn)錄引物在擴(kuò)增cDNA全長(zhǎng)時(shí)是必須的，但要注意，原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾，因此不能使用OligodT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉(zhuǎn)錄酶的選擇，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行無(wú)RNA和無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的對(duì)照。多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過(guò)程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒(méi)有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。②RNaseH活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。逆轉(zhuǎn)錄是2代測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)的前置步驟。

逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來(lái)，可用于合成首先鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉(zhuǎn)錄、測(cè)序和RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本酶是通過(guò)點(diǎn)突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時(shí)其延伸能力也有明顯提高。逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）一個(gè)活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質(zhì)所需的酶量。逆轉(zhuǎn)錄酶的三個(gè)功能：1、RNA為模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；2、DNA為模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。成都cDNA合成反轉(zhuǎn)錄蛋白檢測(cè)

逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程是病毒的復(fù)制形式之一，如RNA病毒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒。成都cDNA合成反轉(zhuǎn)錄蛋白檢測(cè)

大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過(guò)程。此酶需要RNA為引物，多為賴氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒(méi)有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。②RNaseH活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。成都cDNA合成反轉(zhuǎn)錄蛋白檢測(cè)

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