dPCR的測(cè)量結(jié)果通常表示為含量,即拷貝數(shù)值或轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比,而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前市場(chǎng)上可購(gòu)買到大多數(shù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),以qPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以拷貝數(shù)(單倍體基因組當(dāng)量)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表示特性量;以dPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接采用拷貝數(shù)比例來(lái)表示特性量。不同方法使用不同的表示方式,會(huì)造成測(cè)量結(jié)果不可比。因此質(zhì)量分?jǐn)?shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關(guān)系需要轉(zhuǎn)化,才能得到單位一致,數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉(zhuǎn)換因子從拷貝數(shù)換算到質(zhì)量分?jǐn)?shù)。dPCR的結(jié)果統(tǒng)計(jì)方式有2種,一種是采用標(biāo)記多種顏色,另一種采用概率統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法。廣東數(shù)字PCR市場(chǎng)前景
在熒光定量PCR應(yīng)用已經(jīng)如此的情況下,緣何數(shù)字PCR仍然能橫空出世?中心點(diǎn)在于熒光定量PCR盡管為科研和臨床市場(chǎng)應(yīng)用提供了非常重要的檢測(cè)工具支撐,但仍然有尚未被滿足的客戶需求。熒光定量PCR需要基于標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,屬于相對(duì)定量,操作較為復(fù)雜,且終端用戶對(duì)其結(jié)果的重復(fù)性、靈敏性、精密度、分辨率、對(duì)PCR反應(yīng)抑制劑的耐受性等方面有更高的期待。數(shù)字PCR通過(guò)將反應(yīng)體系進(jìn)行有限稀釋至成千上萬(wàn)的反應(yīng)單元中,實(shí)現(xiàn)了核酸靶標(biāo)的單分子擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后,基于終點(diǎn)法對(duì)陽(yáng)性液滴數(shù)和總液滴數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)合泊松分布原理,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始樣本的定量。其極大地簡(jiǎn)化了操作步驟,并且大幅提高了檢測(cè)性能,尤其在低豐度或較低豐度的核酸檢測(cè)上(靈敏性可達(dá)0.001-0.0001%),其優(yōu)異的性能得到了終端用戶的認(rèn)可。珠三角全自動(dòng)數(shù)字PCR數(shù)字PCR主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法。
數(shù)字PCR技術(shù)流分類目前,dPCR的基本方法都已經(jīng)建立,根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式,主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類系統(tǒng)。微液滴制備的方法,目前主流的有四種:1)芯片微孔物理分割法,俗稱物理分隔法,公司有Fluidgm,Qiagen,Roche,ThermoFisher,;2)液滴分割法,俗稱油包水,代替公司有Bio-Rad;3)雜交式芯片液滴法,公司有Stilla;4)注射振動(dòng)制滴法。PS:芯片式物理分割技術(shù)所有已經(jīng)過(guò)期,目前有不少公司在這個(gè)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行開(kāi)發(fā),例如羅氏。
數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(digitalpolymerchainreaction,dPCR)技術(shù)因具有高靈敏度、受基質(zhì)干擾少等優(yōu)勢(shì)而被廣用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。本研究綜述了數(shù)字PCR技術(shù)的原理、系統(tǒng)各部件的優(yōu)劣勢(shì),梳理了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與溯源技術(shù)(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))方面的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì),以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域提供參考依據(jù)。dPCR的擴(kuò)增過(guò)程大致上可以分為3步:樣品的分散、樣品的熱循環(huán)擴(kuò)增和樣品的檢測(cè)。對(duì)于數(shù)字PCR儀器系統(tǒng),各個(gè)部件之間仍然有較大的改進(jìn)空間,要發(fā)揮部件之間的協(xié)同作用是很重要的,而且有持續(xù)研究的價(jià)值。表1中總結(jié)了部分常見(jiàn)的數(shù)字PCR系統(tǒng)的類型,以及相對(duì)在硬件、便攜性、性價(jià)比和自動(dòng)化程度上的比較。在dPCR中,樣品被分區(qū),使得樣品內(nèi)單個(gè)的核酸分子被定位并被集中在許多分離的區(qū)域內(nèi)。
數(shù)字PCR系統(tǒng)的分散方式?jīng)Q定了分散數(shù)量,其結(jié)果基于統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行定量,增加反應(yīng)單元數(shù)量(統(tǒng)計(jì)樣本量),可以增加其檢測(cè)的容量和動(dòng)態(tài)檢測(cè)線性范圍達(dá)到和qPCR相近的動(dòng)態(tài)范圍,同時(shí)減小一個(gè)反應(yīng)單元中包含多個(gè)分子所造成的誤差,達(dá)到提高靈敏度和準(zhǔn)確度。影響dPCR定量結(jié)果的因素包括:儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式。分散方式與數(shù)量由數(shù)字PCR系統(tǒng)決定,分散體積和結(jié)果表達(dá)方式需要實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中優(yōu)化得到。國(guó)產(chǎn)dPCR企業(yè)在上述應(yīng)用領(lǐng)域不斷與伯樂(lè)、賽默飛、羅氏、凱杰、因美納等頭部企業(yè)展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng),搶占市場(chǎng)份額。深圳全自動(dòng)數(shù)字PCR市場(chǎng)前景
dPCR可直接溯源SI國(guó)際單位制摩爾,適合單一、雙重及多重轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究,一次可識(shí)別不同的轉(zhuǎn)基因區(qū)域。廣東數(shù)字PCR市場(chǎng)前景
了解泊松分布,我們先要從二項(xiàng)式分布說(shuō)起,二項(xiàng)式分布是一個(gè)離散概率分布,它給出了m次試驗(yàn)中k次成功的可能性,每次試驗(yàn)的概率為p,例如當(dāng)擲骰子時(shí),二項(xiàng)分布給出了在10次試驗(yàn)中恰好有7次擲出4的概率。在數(shù)字PCR的情況中,投擲骰子類似于將一個(gè)目標(biāo)實(shí)體隨機(jī)“投擲”到一組分區(qū)中,當(dāng)目標(biāo)落在選定的分區(qū)中時(shí),就是成功。如果有n個(gè)分區(qū),并且分區(qū)過(guò)程是完全隨機(jī)的,則目標(biāo)出現(xiàn)在所選分區(qū)中的概率為1/n。該試驗(yàn)重復(fù)m次,樣品中的每個(gè)分子一次。如下所示的二項(xiàng)式分布給出了k個(gè)成功的概率,即所選分區(qū)恰好包含k個(gè)分子的概率。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。當(dāng)n很大,并且嘗試成功的概率(1/n)很小時(shí),二項(xiàng)分布可以近似為泊松分布。廣東數(shù)字PCR市場(chǎng)前景
廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司是我國(guó)數(shù)字PCR,純水機(jī),病理切片機(jī),倍性分析儀專業(yè)化較早的有限責(zé)任公司(自然)之一,公司始建于2015-04-17,在全國(guó)各個(gè)地區(qū)建立了良好的商貿(mào)渠道和技術(shù)協(xié)作關(guān)系。公司承擔(dān)并建設(shè)完成精細(xì)化學(xué)品多項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目,取得了明顯的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。雙螺旋科學(xué)儀器將以精良的技術(shù)、優(yōu)異的產(chǎn)品性能和完善的售后服務(wù),滿足國(guó)內(nèi)外廣大客戶的需求。