實(shí)驗(yàn)樣本分類實(shí)驗(yàn)一般采取樣本有：血液樣本、組織樣本和細(xì)胞樣本。通常，組織樣本采集后，應(yīng)立即用等滲溶液（PBS或生理鹽水）盡量把血液漂洗干凈（除非血液也是分析對(duì)象），用濾紙或紗布吸干，把樣本分切成幾分，每份的體積約2個(gè)黃豆大小，每份用一個(gè)管子裝。血液樣本的采集應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的要求，將會(huì)采取不同策略。血清樣本：全血中不加抗凝劑，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體。（全血標(biāo)本室溫放置2小時(shí)3000rpm/min離心15min）血漿樣本：全血中加抗凝劑，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體。（可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃，3000rpm/min離心15min）如果是做生化\ELISA等檢測(cè)可以考慮血漿和血清，根據(jù)獲得的樣本量可考慮分裝成100-500μl/管，可避免反復(fù)凍融造成的檢測(cè)誤差。生化：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素抗凝血漿；ELISA：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿；凝血實(shí)驗(yàn)：只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿；血常規(guī)：只能選擇EDTA抗凝全血；如果要收集其中的白細(xì)胞、血小板等建議用抗凝全血。如果要做流式建議用專門的流式用血液收集管，防止表面抗原的丟失，或者盡快安排就近檢測(cè)。樣本處理取樣完后。特發(fā)性肺纖維化（IPF）小鼠模型建立。江蘇乳鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室

    經(jīng)多級(jí)乙醇至水洗：二甲苯(i)5min→二甲苯(ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min；4)蘇木素染色5分鐘，自來(lái)水沖洗；5)鹽酸乙醇分化30秒；6)自來(lái)水浸泡15分鐘；7)置伊紅液2分鐘。8)常規(guī)脫水，透明，封片：95％乙醇(i)1min→95％乙醇(ⅱ)1min→100％乙醇(i)1min→100％乙醇(ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(i)1min→二甲苯(ⅱ)1min→中性樹脂封固。9)顯微鏡下拍照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4個(gè)月時(shí)，與ctrl(對(duì)照)小鼠比較，sixko小鼠的視網(wǎng)膜外核層已經(jīng)開始變薄，表明感光細(xì)胞死亡(圖7)。實(shí)施例5視網(wǎng)膜冰凍切片免疫染色：取4月齡的由實(shí)施例2得到的gm20541基因敲除純合子小鼠斷頸處死后，快速取眼球，并放入4％的pfa中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后繼續(xù)冰上固定。2h后，pbs緩沖液沖洗3遍，然后將眼球置于30％蔗糖溶液中脫水2h，然后解剖鏡下剪去角膜及晶體，oct包埋并迅速置于-80℃冰箱冷凍。大約10min后，取出oct包埋的眼球，置于冰凍切片機(jī)-25℃平衡約30min后即可切片。切片厚度為12μm。切片完成后，選取質(zhì)量較高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫組化筆在有視網(wǎng)膜組織的地方畫圈，pbs洗三遍以去除oct。湖南大鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和樣品收集。

    微波爐中融化后制成1％的瓊脂糖膠。取10μlpcr產(chǎn)物于加樣孔中，120v恒壓瓊脂糖電泳15min.用凝膠成像系統(tǒng)成像。圖4中a上方是gm20541條件性敲除鑒定結(jié)果，wt表示野生型對(duì)照，條帶大小為223bp；het表示雜合子，有兩個(gè)條帶223bp和358bp；sixko表示純合子，條帶大小為358bp。圖4中a下方是six3－cre鑒定結(jié)果。six3－cre大小為200bp。根據(jù)圖4中a的結(jié)果，顯示所采用的鑒定方法可對(duì)新生小鼠的基因型進(jìn)行有效鑒定。其中，gm20541基因敲除純合子小鼠即可作為視網(wǎng)膜色素變性疾病模型(后文用sixko或cko表示gm20541基因敲除純合子小鼠；ctr是指野生型；het是指雜合子)，并進(jìn)行相關(guān)表型的驗(yàn)證。(5)rt-pcr實(shí)驗(yàn)分析six3-cre敲除小鼠視網(wǎng)膜中基因敲除效率驗(yàn)證，方法如下：(a)分別分離野生型和突變型小鼠視網(wǎng)膜組織，置于，加入1mltrizol提取液，室溫20分鐘；(b)加入200μl氯仿，充分混勻，室溫靜置10分鐘；(c)將樣品置于4度離心機(jī)，10000轉(zhuǎn)離心15分鐘；(d)小心吸取上清液，加入等體積異丙醇，充分混勻，10000轉(zhuǎn)離心沉淀rna；(e)75％乙醇清洗析出的總rna，離心再次沉淀，然后晾干加入depc水溶解；(f)提取的總rna用cdna合成試劑盒(invitrogen,waltham,ma,usa)合成cdna。

    結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些組織中，gm20541均有表達(dá)，說(shuō)明該基因可能在體內(nèi)發(fā)揮重要功能。2采用免疫印跡(westernblot)的方法檢測(cè)gm20541基因在不同組織中的表達(dá)。方法：(1)分別獲取小鼠腦、肝臟、視網(wǎng)膜、心臟、腎臟以及脾，充分研磨后加入200μl蛋白裂解液ripa。(2)超聲破碎細(xì)胞后，在冰上裂解20min。(3)4℃，16000g離心10min后，取上清轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管，加入50μl的蛋白上樣液，混勻后95℃加熱5min。(4)待樣本冷卻后，分別取20μl，160v電壓進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)以分離蛋白。(5)sds-page結(jié)束后，根據(jù)需要，裁剪適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜，按順序鋪上濾紙、膠、硝酸纖維素膜及濾紙，并趕去氣泡，轉(zhuǎn)膜槽放入冰水浴中，采用恒流，轉(zhuǎn)膜2h。(6)轉(zhuǎn)膜完畢后，純水沖洗硝酸纖維素膜一遍，晾干并標(biāo)記。然后用8％的脫脂牛奶封閉2h。(7)封閉完成后，加入一定量的按一定比例(按照抗體使用說(shuō)明書)稀釋于封閉液的一抗，4℃孵育過(guò)夜。(8)回收一抗，1×tbst緩沖液洗膜4次，每次10min，根據(jù)一抗來(lái)源，選擇合適二抗，用1×tbst稀釋辣根過(guò)氧化氫酶(hrp)標(biāo)記的二抗，室溫于搖床上孵育2h。(9)二抗孵育結(jié)束后，用1×tbst洗膜3次，每次10min，用thermo的elc發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白。小鼠腎纖維化（UUO）模型建立。

    然后5％的nds。含有％triton)封閉通透2h，孵育一抗，4℃過(guò)夜。第二天，pbs清洗三次后，孵育相應(yīng)的熒光二抗，然后再用pbs清洗三次，封片，觀察。結(jié)果見圖8，在小鼠4月齡時(shí)，通過(guò)視網(wǎng)膜冰凍組織切片染色外節(jié)抗體rhodopsin以及內(nèi)節(jié)抗體nak-atpase后發(fā)現(xiàn)，相較于野生型小鼠，gm20541基因敲除純合子小鼠(圖中sixko)視網(wǎng)膜外節(jié)明顯縮短，表現(xiàn)出了明顯退化表征。綜上，可以看出，本發(fā)明實(shí)施例以小鼠為例，通過(guò)cre-loxp基因敲除技術(shù)，在小鼠視網(wǎng)膜前體細(xì)胞中特異性敲除gm20541基因，小鼠表現(xiàn)出了視力受損，視細(xì)胞外節(jié)變短退化以及視細(xì)胞丟失等視網(wǎng)膜色素變性疾病典型表征。由此充分說(shuō)明，在視網(wǎng)膜前體細(xì)胞敲除gm20541基因，可以使目標(biāo)動(dòng)物表現(xiàn)出視網(wǎng)膜色素變性疾病。視網(wǎng)膜前體細(xì)胞敲除gm20541基因的動(dòng)物，可以作為視網(wǎng)膜色素變性疾病模型。該疾病模型可以用于視網(wǎng)膜色素變性疾病研究等領(lǐng)域中，為該疾病的研究例如發(fā)病過(guò)程、機(jī)制以及相關(guān)藥物的篩選提供一種新的模型。雖然本發(fā)明實(shí)施例展示了在小鼠的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞敲除gm20541基因后的表型，但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解到，小鼠作為哺乳動(dòng)物的代表性動(dòng)物，在其他的哺乳類動(dòng)物中敲除gm20541基因或其同源基因也應(yīng)當(dāng)具有相似的表型。臨床上平時(shí)不易見到的疾病可用動(dòng)物隨時(shí)復(fù)制出來(lái)。江蘇腦定位動(dòng)物模型服務(wù)

脂多糖（LPS）聯(lián)合煙熏法致慢性阻塞性肺部疾病小鼠模型。江蘇乳鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室

    然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。要熟悉采集部位。要能準(zhǔn)確的按解剖部位采集，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部；肺應(yīng)取有細(xì)支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。如果實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行多組織樣本的采集，采集順序應(yīng)按照：消化，神經(jīng)系統(tǒng)，皮膚，肌肉等的順序進(jìn)行。選好組織塊的切面。熟悉某些組織成分安排，然后決定其切面的走向；如一長(zhǎng)管狀以橫切面較好。切除不需要的部分。特別是組織周圍的脂肪等，應(yīng)盡可能掉，否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來(lái)一些不必要的問(wèn)題。組織樣品的固定（1）固定的方法：①小塊組織固定法：從動(dòng)物取下的小塊組織，立即置入液態(tài)固定劑（這是應(yīng)用經(jīng)常的方法）。②注射/灌注固定法：某些組織塊由于體積過(guò)大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物進(jìn)行固定，這時(shí)宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織和全身，從而得到充分的固定。另，空腔組織比如肺，肺內(nèi)含有空氣，固定液難以滲入，建議先做肺灌注，使得肺充盈滿固定液以后再進(jìn)行保存，如果空腔中氣體沒(méi)有有效排出，后續(xù)可能影響固定效果（沒(méi)有灌注的肺組織會(huì)浮在液體表面不利于固定，切片以后也會(huì)看到很多的空泡）。③蒸汽固定法：比較細(xì)小而薄的標(biāo)本。江蘇乳鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室