如何合理的選擇核酸提取的方法?在進行核酸提取時我們首先要明確本次實驗對提取的要求,而且要了解幾種不同核酸提取方法的優(yōu)劣所在。一般地,分離純化步驟越多,核酸的純度也越高,但得率會逐漸下降,完整性也愈難以保證。相反,通過分離純化步驟少的實驗方案,我們可以得到比較多的完整性較好的核酸分子,但純度不一定很高。這需要結合核酸的用途而加以選擇。如果對核酸提取的質量要求不高,可以選擇經濟實惠的溶液法,選擇柱膜法還是磁珠法自動化提取,基本上取決于樣本數(shù)量,針對大批量的樣本,推薦磁珠法自動化提取。如果對樣本數(shù)量較少,則可以選擇柱膜法,既快速又經濟實用。磁珠法核酸提取原理。廣州復制型逆轉錄病毒核酸提取公司
核酸提取純化的總原則是要保證核酸一級結構的完整性,防止降解,同時要排除其他分子的污染。因為一級結構是核酸分子**基本的結構,儲存著全部的遺傳信息,是進一步研究的基礎。為了保持核酸的完整性,在提取過程中要注意防止核酸酶對核酸的降解。還要防止化學因素(酸堿等)和物理因素(高溫或機械剪切等)引起核酸變性或破壞。制備RNA要特別注意防止核酸酶的作用,因為核酸酶分布很廣,活力很高;而對DNA更重要的是防止張力剪切作用,因為DNA分子特別長,容易斷裂。對于核酸的提取純化應達到以下三點要求:①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子;②其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到比較低程度;③排除其他核酸分子的污染,如提取DNA分子時,應去除RNA分子,反之亦然。廣州RCR核酸提取常見問題南京正揚生物有自動化核酸提取試劑盒嗎?
核酸提取時的關鍵因素及對提取的影響:在進行核酸提取或純化時,必須密切注意一些因素,如pH值、鹽濃度、溫度、緩沖體積和潛在的乙醇污染。這些因素中的每一個都會極大地影響下游實驗的得率、質量和成功率。1、非適pH值或鹽濃度可改變核酸的電荷,導致核酸不能與離心柱結合,或導致苯酚/氯仿錯誤的溶解核酸。2、溫度的不正確可能會導致樣本裂解或者是樣本消化的效果不好,進而會影響后續(xù)核酸提取的效果不好。2、緩沖液體積不正確,可導致不完全裂解,中和或間接稀釋洗脫的核酸。3、乙醇污染可以抑制下游的酶反應。
核酸是遺傳信息的攜帶者,是基因表達的物質基礎,是分子生物學研究的主要對象。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(rRNA),信使RNA(mRNA)和轉移RNA(tRNA)。DNA主要集中在細胞核內,線粒體和葉綠體中,而RNA主要分布在細胞質當中。如果要對核酸的結構和功能進行研究,不可避免的就要對核酸進行提取和純化。核酸提取是指把樣本中的核酸提取出來;而核酸純化是為了提高提取從樣本中提取出來的核酸的質量。宿主細胞殘留核酸提取時,提取效果不理想的原因可能有哪些?
PVP在核酸提取似乎嚴重可以起到去除雜質,提高DNA純度的作用。其工作原理是:減少酚類、醌類、單寧類物質的影響,抗氧化作用,絡合多酚和萜類物質,防止多酚類褐變而氧化,去除多糖和色素,色素是PCR強抑制劑,必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入PVP或PVPP等能絡合多酚和萜類物質,離心或氯仿抽提出去,有效防止多酚氧化成醌類,避免溶液變褐色而具有抗氧化能力。提取液中加入適量的PVP或PVPP能提高DNA的純度,用量根據(jù)雜質而定(1-6%),PVP同時能去除多糖,因此將PVP和巰基乙醇配合使用并調整用量,能有效防止多酚污染PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物,能與多酚形成一種不溶的絡合物質,有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時它也能和多糖結合,有效去除多糖。南京正揚宿主細胞殘留核酸提取試劑盒的裝量是多少?廣州復制型逆轉錄病毒核酸提取公司
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在核酸提取中基本上都會用到異丙醇和70%乙醇,那么這兩個試劑在核酸提取中的作用原理是什么呢?異丙醇起到的是使DNA沉淀的作用,而且異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好,但是異丙醇沉淀有一個弊端就是會沉淀下來好多的鹽和蛋白質這樣會影響下一步的操作,一般我加異丙醇是等體積的效果還可以。70%乙醇一般用于洗滌DNA沉淀(因為在70%乙醇里DNA是不溶的,而鹽離子卻可溶),用無水乙醇則達不到這個目的!乙醇對于蛋白質、核酸的沉淀效應隨分子量加大而增大,小分子的核酸和蛋白質碎片是可以溶于75%乙醇的。漂洗DNA,是為了去除殘余的鹽類,去除過量SDS和酚等雜物,因為SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài),不與DNA共沉淀,從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應的影響。廣州復制型逆轉錄病毒核酸提取公司