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用qPCR法進(jìn)行rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測時(shí),出現(xiàn)擴(kuò)增效率超出標(biāo)準(zhǔn)要求(低于83.3%或高于110%)的原因有哪些?①設(shè)計(jì)的引物探針不適用:重新分析靶標(biāo)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。②標(biāo)曲濃度設(shè)定太高,超出標(biāo)曲線性范圍:對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證,選取合適標(biāo)曲范圍。③人員操作問題,如稀釋錯(cuò)誤、制備過程震蕩時(shí)間過長等:人員上崗前應(yīng)接受多面培訓(xùn)并做到熟練操作,考核合格后方可上崗。④移液器未校準(zhǔn)或品質(zhì)問題導(dǎo)致量取不準(zhǔn):定期對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)并選擇好品質(zhì)移液器。復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測適用性樣品有哪些?復(fù)制型病毒檢測優(yōu)缺點(diǎn)
生物檢測通常用于篩選載體產(chǎn)品中的RCR,而對(duì)輸注后患者的監(jiān)測則依賴于分子或血清學(xué)檢測。分子和血清學(xué)檢測比生物檢測更快,消耗的資源更少;然而,它們也很容易給出誤報(bào)。蕞常用的RCR病毒檢測是擴(kuò)展的S+/L-測定和標(biāo)記拯救測定。蕞常見的RCL生物測定方法是通過在增殖階段將包裝細(xì)胞中的潛在RCL擴(kuò)增至更高滴度,然后進(jìn)行ELISA或分子測定。迄今為止,在病毒載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)物或受體患者中尚未報(bào)告陽性RCR/RCL結(jié)果。因此,一些研究人員建議,可能是時(shí)候修改FDA指南中對(duì)RCR/RCL監(jiān)測的要求。上海RCR病毒檢測價(jià)格qPCR法復(fù)制型慢病毒檢測的優(yōu)點(diǎn)有哪些?
RCL/RCR病毒檢測的方法FDA推薦的RCL檢測方法是利用敏感細(xì)胞對(duì)病毒載體中可能存在的RCL進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,并在培養(yǎng)終點(diǎn)進(jìn)行檢測。?擴(kuò)增期:將待測物與對(duì)HIV-1易感并且可大量擴(kuò)增病毒的細(xì)胞系(通常用C8166)孵育,細(xì)胞傳代5次以上,培養(yǎng)至少3周。?指示期:3周后收集培養(yǎng)上清,接種于C8166細(xì)胞中培養(yǎng)7d后檢測RCL標(biāo)志物。?檢測:A:P24ELLISA的方法:適用于由載體制備過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測。B:PERT法:當(dāng)RCL進(jìn)行擴(kuò)增后,也可應(yīng)用PERT檢測方法測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。該方法的缺點(diǎn)是在某些細(xì)胞中存在高背景。C:qPCR方法:采用實(shí)時(shí)定量PCR方法(Q-PCR)測定假型病毒
基于細(xì)胞培養(yǎng)法的rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測方法,該方法的原理是通過不斷的細(xì)胞傳代使得rcAAV實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,之后再利用qPCR或Southern-blot的方法對(duì)rcAAV進(jìn)行檢測,能保證檢測到的rcAAV都具有復(fù)制能力,是目前蕞常用的檢測方法。然而,該方法和檢測平臺(tái)建立有一定難度,需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求建立易感的細(xì)胞株,還需建立均一標(biāo)定的輔助病毒庫以及作為陽性對(duì)照的wtAAV病毒庫,核酸提取、檢測階段一般都需要進(jìn)行富集,耗時(shí)較長且投入成本較高。復(fù)制型慢病毒檢測請(qǐng)聯(lián)系南京正揚(yáng)。
RCL復(fù)制型慢病毒檢測的背景:CAR-T(chimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy),即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。它是一種醫(yī)治種瘤的新型精確靶向療法,能夠精確、高效,且有希望治好ai癥的免疫醫(yī)治方法。目前,主要有兩種病毒載體用于CAR-T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo):γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。目前基因醫(yī)治產(chǎn)品所用慢病毒載體均是非復(fù)制型的,但在病毒包裝過程中,可能會(huì)由于同源或非同源重組等機(jī)制產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒(RCL)。出于安全、有效、質(zhì)量可控的考慮,應(yīng)當(dāng)對(duì)該類病毒進(jìn)行檢測,以避免在人體內(nèi)無控地自我復(fù)制,造成傷害,防止發(fā)生臨床安全性隱患事件。重組腺相關(guān)病毒檢測要求有哪些?杭州RCL病毒檢測服務(wù)
復(fù)制型病毒檢測試劑盒方法有哪些?復(fù)制型病毒檢測優(yōu)缺點(diǎn)
RCL復(fù)制型慢病毒檢測方法包括以下3種:①ELISA法(p24蛋白測定):適用于由載體生產(chǎn)過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測。但,對(duì)于VSV-G包膜質(zhì)粒和來源于其他病毒的gal-pol基因功能組件之間發(fā)生重組不表達(dá)p24蛋白的假型病毒不適用。其優(yōu)點(diǎn)為適用性廣(濃縮載體、終末細(xì)胞、血清血漿等多種樣本)、靈敏度高和可定量等。②使用qPCR的方法測定VSV-G基因和PCR方法檢測由病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒重組產(chǎn)生的psi-gag基因序列,具有靈敏度高,可重復(fù)性和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。③測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的方法,它可以用來檢測RCL相關(guān)的不同結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)病毒,缺點(diǎn)為在某些細(xì)胞檢測中,存在背景高的現(xiàn)象。復(fù)制型病毒檢測優(yōu)缺點(diǎn)