逆轉(zhuǎn)錄酶的合成步驟：1、使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；2、取滅過菌且無核酸酶的0.2ml離心管，依次加入2～5μgRNAnμL；3、65℃保溫5min，然后冰浴5min；4、往3步驟中的0.2ml離心管依次加入下列組份：RNase抑制劑（40u/μL）0.5μL、10×M-MLVReactionBuffer2μL、DTT（200mM）1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）1μL；5、輕輕混勻后，然后2000rpm離心20s；6、先在37℃保溫1hr，然后70℃保溫15min；7、上述產(chǎn)物可立即進行下一步的PCR反應(yīng)或-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄酶的質(zhì)量控制：物理純度：在SDS－PAGE上>90%純。儲存緩沖液：20mMTris-HClpH7.5；200mMNaCl；0.1mMEDTA；1mMDTT；0.01%NP-40(一種去垢劑)和50%甘油。反應(yīng)緩沖液：250mMTris-HClpH8.3；375mMKCl；15mMMgCl2；50mMDTT(以Part#M531A供應(yīng))。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物中，RNA同樣兼有遺傳信息傳遞和表達功能。深圳彩色逆轉(zhuǎn)錄酶企業(yè)

逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成DNA的過程，即將遺傳信息由RNA逆向傳給DNA的過程，其遺傳的傳遞方向與轉(zhuǎn)錄相反。反轉(zhuǎn)錄酶也可寫成逆轉(zhuǎn)錄酶又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。煙臺miQP2逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)常與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，艾滋、乙肝等很多疾病也有逆轉(zhuǎn)錄過程。

逆轉(zhuǎn)錄的作用：除了病毒外，逆轉(zhuǎn)錄還在其他方面發(fā)揮了重要的作用。例如，在一些動物體內(nèi)，逆轉(zhuǎn)錄過程會導(dǎo)致基因的重組。這種重組可以使新的基因產(chǎn)生，從而使動物產(chǎn)生新的特征。此外，逆轉(zhuǎn)錄還可以作為某些基因的調(diào)節(jié)機制，從而控制基因的表達和功能。逆轉(zhuǎn)錄的研究一直是生物學(xué)領(lǐng)域的熱點之一。研究人員希望通過了解逆轉(zhuǎn)錄酶的工作機制，從而找到一些新的方法來治著某些疾病。例如，在艾滋毒的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些能夠抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物，從而使得病毒無法復(fù)制。這些藥物已經(jīng)被普遍應(yīng)用于艾滋的治著中，并且取得了明顯的療效。

反轉(zhuǎn)錄酶的選擇：反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR，理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的RNA，并確保在整個反應(yīng)過程中的全部活性，從而得到質(zhì)量更高的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染。

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項，引物的選擇，OligodT：選擇OligodT時，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，較好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。特異性引物：特異性引物只能用你設(shè)計引物時的下游引物做RT，引物設(shè)計質(zhì)量影響RT的結(jié)果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個溫度做不是較佳選擇，一般不推薦。逆轉(zhuǎn)錄實驗要使用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物，避免引物交叉污染。深圳彩色逆轉(zhuǎn)錄酶企業(yè)

逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中需要考慮RNA模板質(zhì)量和RNA純化的方法。深圳彩色逆轉(zhuǎn)錄酶企業(yè)

RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計原則：1.上下游引物要保守：擴增子長度需選擇一段保守片段（100-200bp）進行PCR擴增，選擇片段需跨越內(nèi)含子，因內(nèi)含子的基因組DNA序列不會被擴增，也可減少從污染的基因組DNA中擴增得到的假陽性風(fēng)險。引物選取同樣需要保守。2.引物長度和Tm值：引物設(shè)計長度為18-25bp，Tm值在50-65℃之間，引物中GC含量在40-60%。設(shè)計引物時盡量避免出現(xiàn)4個或超過4個G堿基。RT-PCR實驗陰性對照：反轉(zhuǎn)錄陰性對照應(yīng)包括在所有的RT-PCR的實驗中，用來檢測DNA是否污染（如基因組DNA或PCR產(chǎn)物）。該對照所指不加反轉(zhuǎn)錄酶，通過反轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA在進行熒光定量PCR檢測。如檢測到擴增，則樣本中可能含有基因組DNA污染。深圳彩色逆轉(zhuǎn)錄酶企業(yè)