逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程與端粒復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄酶通常具有多種活性，如逆轉(zhuǎn)錄活性、復(fù)制活性與RNA酶H活性。逆轉(zhuǎn)錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補(bǔ)的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。RNA酶H活性可以水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈（cDNA）。復(fù)制活性則用來(lái)合成雙鏈DNA。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性部位。與復(fù)制類(lèi)似，逆轉(zhuǎn)錄也是由5’向3’合成DNA，要求有模板和不少于四個(gè)核苷酸的引物。各種DNA聚合酶活性都需要引物，只有確認(rèn)引物正確配對(duì)，才會(huì)進(jìn)行DNA的合成。這是保證其忠實(shí)性的重要手段，逆轉(zhuǎn)錄酶也不例外。實(shí)驗(yàn)室合成cDNA時(shí)，經(jīng)常會(huì)用合成的寡聚T（oligodT）作為引物，與mRNA的polyA配對(duì)。這個(gè)過(guò)程比較簡(jiǎn)單，因?yàn)橐锝Y(jié)合在RNA鏈的末端，所以整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄是一次性完成的。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前應(yīng)反復(fù)檢查所有試劑盒的有效期和使用條件。溫州cDNA合成反轉(zhuǎn)錄

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比AMV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性，因此要獲得像AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中產(chǎn)生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA，要用8單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶才相當(dāng)于1單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制，該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉(zhuǎn)錄酶5X反應(yīng)緩沖液，也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液，因?yàn)檫@二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量，過(guò)少或質(zhì)量不佳將影響擴(kuò)增效果。溫州cDNA合成反轉(zhuǎn)錄高效的逆轉(zhuǎn)錄體系可提高反應(yīng)效率和檢測(cè)靈敏度。

逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來(lái)，可用于合成首先鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉(zhuǎn)錄、測(cè)序和RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本酶是通過(guò)點(diǎn)突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時(shí)其延伸能力也有明顯提高。逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）一個(gè)活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質(zhì)所需的酶量。逆轉(zhuǎn)錄酶的三個(gè)功能：1、RNA為模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；2、DNA為模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。

miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄：miRNA加尾法利用基因組中壓縮miRNA元件，通過(guò)識(shí)別不同轉(zhuǎn)錄起始位置，將miRNA連接到其前體mRNA上這種方法可以注意到與miRNA相關(guān)的各種信息，例如miRNA功能特異性，miRNA的轉(zhuǎn)錄條件和miRNA的表達(dá)量等。miRNA的逆轉(zhuǎn)錄允許科學(xué)家們用特定的miRNA測(cè)序技術(shù)來(lái)節(jié)省時(shí)間。miRNA逆轉(zhuǎn)錄，可以檢測(cè)miRNA的表達(dá)以及miRNA與RNA的瓦作關(guān)系，還可以檢測(cè)miRNA的調(diào)節(jié)的位點(diǎn)。同樣，miRNA表達(dá)量的研究也能夠通過(guò)miRNA逆轉(zhuǎn)錄來(lái)進(jìn)行，從而幫助我們更好地了解miRNA在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。逆轉(zhuǎn)錄在病毒學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域有普遍的應(yīng)用。

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng)，在進(jìn)行RT反應(yīng)之前，應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：RNA：成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過(guò)程中，要特別防止RNase的污染，同時(shí)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過(guò)程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)Nase抑制劑只防止RNaseA，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常更換新手套。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)盡量避免多次凍融處理RNA樣品，避免樣品質(zhì)量下降。溫州cDNA合成反轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要使用干燥無(wú)菌的管頭和標(biāo)本采集器避免受外界污染。溫州cDNA合成反轉(zhuǎn)錄

miRNA加尾法及其逆轉(zhuǎn)錄是近年來(lái)普遍用于miRNA研究的一種技術(shù)。它可以幫助我們深入理解miRNA的調(diào)控機(jī)制，它質(zhì)量得到改進(jìn)，效率也得到提高從而為miRNA研究提供了非常重要的資源。未來(lái),miRNA加尾法及其逆轉(zhuǎn)錄一定會(huì)成為miRNA研究的重要部分，為miRNA研究提供更多有價(jià)值的信息。逆轉(zhuǎn)錄是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，它在病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄還可以作為基因的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而控制基因的表達(dá)和功能。我們相信，在未來(lái)的研究中，逆轉(zhuǎn)錄的研究將會(huì)取得更多的進(jìn)展，并且會(huì)為治著某些疾病提供更多的幫助。溫州cDNA合成反轉(zhuǎn)錄