RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（Reversetranscription-PCR，RT-PCR），是以RNA為材料應(yīng)用于PCR擴增中的一種實驗方法。首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA或信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）。其次TaqDNA聚合酶以cDNA為模板進行qPCR擴增。RT-PCR已被普遍應(yīng)用于多種分子生物學(xué)應(yīng)用中，包括基因表達分析、基因測試、RNA干擾驗證檢測、微陣列驗證、病原體檢測和疾病研究。RT-PCR的方法之一步法和兩步法：RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，分成兩步進行。酵母菌逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一個重要表示。廣州加尾法逆轉(zhuǎn)錄測序

逆轉(zhuǎn)錄實驗步驟：引物濃度計算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）。用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行RT（10ul體積）1、準(zhǔn)備0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA。3、稍離心，100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉(zhuǎn)錄酶。5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min滅活A(yù)MV。7、立即PCR或－20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄實驗時注意事項：為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。深圳莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄酶制造商逆轉(zhuǎn)錄實驗完成反應(yīng)后要及時保存和處理PCR產(chǎn)物，并記錄實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果等。

逆轉(zhuǎn)錄常見問題及解決方法之RNA濃度不高：a)、原始組織樣本或細(xì)胞量太少:提高加入量。b)、RNA發(fā)生降解:如果使用者確定提取RNA的試劑/器具沒有問題，RNA的降解通常發(fā)生在樣品破碎/勻漿階段。有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源RNase活性:1.立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。這只適合培養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)源RNase含量較低的并且較容易勻漿的組織，2.對于內(nèi)源RNase含量高或不易勻漿的組織，如肝臟、胰腺、脾臟、肌肉等，或植物組織，需要切成小塊后立即投入液氮冷凍，再按說明進行破碎/勻漿。c)、加入異丙醇后室溫沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可，無需過夜沉淀。

逆轉(zhuǎn)錄引物：加尾法逆轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)構(gòu)并不是想象中那么簡單的oligodT，其包含三個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)：①為了與PolyA序列互補配對，OligodT序列必不可少。②在OligodT序列的5端，存在一段通用序列，用于qPCR過程中反向引物與cDNA的結(jié)合。③OligodT序列的3端存在一個或兩個錨定堿基，V或者VN。(兼并堿基，V表示A、G或C，N表示ATCG中的任意一種)。如果沒有錨定堿基，逆轉(zhuǎn)錄引物中的OligodT就會隨機結(jié)合到PolyA的任意位置，這樣會造成同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度不一，給較后的熔解曲線檢測帶來麻煩。因此，錨定堿基的作用就是特異性地結(jié)合到miRNA上，從而讓逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到緊挨著miRNA的那段PolyA序列上。只有這樣，才能夠保證同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小相同。逆轉(zhuǎn)錄實驗避免RNA樣品的過凍、過熱處理，影響逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效果。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的用途普遍，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、檢測細(xì)胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測、檢測病人標(biāo)本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環(huán)境脅迫對植物基因表達的影響，以及在特定的環(huán)境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用RT-PCR檢測分析RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點：理論上可以檢測幾乎任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；可以實現(xiàn)極為微量RNA樣品（ng級別）的檢測；樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測。逆轉(zhuǎn)錄酶通常具有多種活性，如逆轉(zhuǎn)錄活性、復(fù)制活性與RNA酶H活性。深圳莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄酶制造商

逆轉(zhuǎn)錄可改變RNA的信息內(nèi)容，為研究RNA功能提供基礎(chǔ)。廣州加尾法逆轉(zhuǎn)錄測序

逆轉(zhuǎn)錄試劑是一類普遍應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的試劑，它們可以用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的實驗操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的過程，與正常的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過程相反。逆轉(zhuǎn)錄試劑可以促進這個過程的進行，從而使得研究人員能夠更好地了解RNA的結(jié)構(gòu)和功能。逆轉(zhuǎn)錄試劑通常由逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液和酶的輔助因子組成。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種酶類蛋白質(zhì)，它可以在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起到關(guān)鍵的作用。緩沖液的主要作用是維持反應(yīng)體系的PH值和離子強度，從而保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進行。酶的輔助因子（如酶抑制劑）則可以幫助研究人員減少誤差和提高實驗的可重復(fù)性。廣州加尾法逆轉(zhuǎn)錄測序

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