逆轉(zhuǎn)錄過程是病毒的復(fù)制形式之一，如RNA病毒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒，DNA病毒中的擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制均需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過程在真核細(xì)胞中也同樣存在，例如逆轉(zhuǎn)座子和端粒DNA的延長均存在逆轉(zhuǎn)錄過程，需逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，端粒酶即為真核細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄過程的揭示是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對中心法則的重要修正和補(bǔ)充。人們通過體外模擬該過程，以樣本中提取的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補(bǔ)的cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術(shù)中較常用的獲得目的基因的策略之一。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量，過少或質(zhì)量不佳將影響擴(kuò)增效果。一體化逆轉(zhuǎn)錄試劑RNA提取

逆轉(zhuǎn)錄的過程：生物體中的逆轉(zhuǎn)錄過程就比較復(fù)雜，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）。病毒是真正的“極簡風(fēng)”，所有東西都壓縮到非常。比如它的基因組中，經(jīng)常有些基因是重疊、嵌套結(jié)構(gòu)，充分利用每一個(gè)堿基。所以它也不會(huì)專門編碼一個(gè)引發(fā)酶來合成引物，它一般是在組裝時(shí)帶走宿主的tRNA，在下次侵染時(shí)當(dāng)作引物使用。被用作引物的tRNA會(huì)結(jié)合在病毒基因組RNA鏈的中間，所以首先次只能合成出一部分cDNA，然后利用基因組RNA兩端的一段重復(fù)序列，“跳”回另一端，完成整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄。之后水解RNA鏈的時(shí)候，會(huì)留下一些片段作為復(fù)制的引物。雙鏈DNA的合成同樣也需要經(jīng)過一次跳躍（jump），以合成完整雙鏈。較后兩端具有相同的序列，稱為長末端重復(fù)（longterminalrepeats，LTR）。LTR不只包含跳躍時(shí)用來配對的序列，還有整合信號、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、polyA位點(diǎn)等重要結(jié)構(gòu)。帶gDNA Remover逆轉(zhuǎn)錄酶企業(yè)酵母菌逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一個(gè)重要表示。

逆轉(zhuǎn)錄時(shí)試劑沒混勻會(huì)怎么樣？會(huì)出現(xiàn)起泡現(xiàn)象。RT-PCR的試劑都應(yīng)在冰上融化，等完全融化后再??；用過的試劑應(yīng)瞬間離心后放回-20℃保存；試劑應(yīng)按順序加，加完后再混勻離心。使用ReverTra-Ace、RNase-Inhibitor等酶類時(shí)，沒有混勻，會(huì)出現(xiàn)起泡現(xiàn)象；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。miRNA的RT-PCR:1）引物稀釋：miRNARTPrimer儲(chǔ)存液濃度：10μM。miRNARTPrimer工作液濃度：2μM。RTPrimer工作液配置：5μLRT-primer儲(chǔ)存液+45μLDEPC水。miRNA前后引物的工作液（10μM）用儲(chǔ)存液（100μM）稀釋后分裝，放入-20℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。

多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動(dòng)作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補(bǔ)的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(cDNalibrary)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中較常用的獲得目的基因的方法。HIV病毒復(fù)制的一個(gè)重要步驟就是逆轉(zhuǎn)錄。

逆轉(zhuǎn)錄常見問題及解決方法之組織提?。篟NAisolater可以提取miRNA嗎?可以提取miRNA。他普遍適用于培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物組織、微生物以及代謝較少的植物組織，如幼苗、幼葉等。提取的RNA有基因組DNA污染：a)、向裂解液中加入氯仿后，需要在低溫下(2-8°C)高速離心。離心后，RNA被抽提到上層的水相中，中、下層是有機(jī)相，含有氯仿。DNA即存在于中層。氯仿在常溫下會(huì)與水以一定比例互溶，因此，常溫離心會(huì)導(dǎo)致上層水相中也有少量基因組DNA污染。吸取上層液體時(shí)，應(yīng)非常小心，避免吸到中間層和下層，為此失去一點(diǎn)得率，保留一些上清不吸是非常值得的。RNA應(yīng)如何保存：建議分裝后在-80℃長期保存，在-20℃可以短期保存，但需要盡快使用。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中的RNA樣品處理時(shí)要避免使用酸性物質(zhì)、有機(jī)溶劑和酶切酶劑。武漢莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄哪家劃算

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)要記錄反應(yīng)體系的溫度、時(shí)間、反應(yīng)試劑的添加量等參數(shù)。一體化逆轉(zhuǎn)錄試劑RNA提取

RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)原則：1.上下游引物要保守：擴(kuò)增子長度需選擇一段保守片段（100-200bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇片段需跨越內(nèi)含子，因內(nèi)含子的基因組DNA序列不會(huì)被擴(kuò)增，也可減少從污染的基因組DNA中擴(kuò)增得到的假陽性風(fēng)險(xiǎn)。引物選取同樣需要保守。2.引物長度和Tm值：引物設(shè)計(jì)長度為18-25bp，Tm值在50-65℃之間，引物中GC含量在40-60%。設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避免出現(xiàn)4個(gè)或超過4個(gè)G堿基。RT-PCR實(shí)驗(yàn)陰性對照：反轉(zhuǎn)錄陰性對照應(yīng)包括在所有的RT-PCR的實(shí)驗(yàn)中，用來檢測DNA是否污染（如基因組DNA或PCR產(chǎn)物）。該對照所指不加反轉(zhuǎn)錄酶，通過反轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA在進(jìn)行熒光定量PCR檢測。如檢測到擴(kuò)增，則樣本中可能含有基因組DNA污染。一體化逆轉(zhuǎn)錄試劑RNA提取

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