反轉(zhuǎn)錄酶的選擇：反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR，理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的RNA，并確保在整個反應(yīng)過程中的全部活性，從而得到質(zhì)量更高的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。北京快速逆轉(zhuǎn)錄試劑價格

RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：去除基因組DNA污染：殘留的基因組DNA(gDNA)會對熒光定量結(jié)果造成很大的干擾，為了使結(jié)果更加的真實、可重復(fù)，我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計時避免gDNA的擴增，比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上；或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后，我們還有非常法寶，選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性：逆轉(zhuǎn)錄酶在整個反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少RNA的二級結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”，高于37℃時，穩(wěn)定性大幅下降。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑穩(wěn)定性高逆轉(zhuǎn)錄是許多病毒復(fù)制中必不可少的步驟。

逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)有重要的理論意義和實踐意義。（1）在致死病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了病基因，在人類一些病細胞如膀胱病、小細胞肺病等細胞中，也分離出與病毒病基因相同的堿基序列，稱為細胞病基因或原病基因。病基因的發(fā)現(xiàn)為疙瘩發(fā)病機理的研究提供了很有前途的線索。（2）在實際工作中有助于基因工程的實施。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備，可將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成DNA用以獲得目的基因。逆轉(zhuǎn)錄酶實驗操作注意事項：RNA提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；RNA提取完馬上進行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的RNA很容易降解；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無RNAase環(huán)境，以避免模板RNA降解。RNase是RNA水解酶的統(tǒng)稱，包含RNaseA，RNaseH等，RNaseA可以水解單雙鏈RNA，RNaseH主要水解RNA與DNA雜交雙鏈中的RNA。

人體中也有逆轉(zhuǎn)錄過程，比如端粒的復(fù)制。端粒（telomere）是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由重復(fù)的DNA序列（TTAGGG）和核的蛋白組成，可以保護染色體末端，維持基因組完整性。端粒的末端是單鏈3'末端，形成一種緊湊的T環(huán)結(jié)構(gòu)，可保持其穩(wěn)定性。其表面覆蓋著Shelterin復(fù)合物，包括TRF1（端粒重復(fù)結(jié)合因子1）、TRF2（端粒重復(fù)結(jié)合因子2）、TIN2（TRF1相互作用核的蛋白2）、RAP1（rif相關(guān)蛋白）、POT1（端粒保護）和TPP1（端粒保護蛋白1）成功將人表皮干細胞體外分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對比觀察不同發(fā)育階段人表皮干細胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達的差異特征，結(jié)果表明人胚胎、少兒、成人皮膚來源的表皮干細胞均有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達，其表達強度依次減弱。提示誘導(dǎo)和增強端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達對維持表皮干細胞在體外自我更新和增殖能力可能具有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)的發(fā)展使RNA研究得到極大便利。

逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉(zhuǎn)錄酶的選擇，逆轉(zhuǎn)錄實驗前要對反應(yīng)體系進行無RNA和無反轉(zhuǎn)錄酶的對照。多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。逆轉(zhuǎn)錄是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA的生物化學(xué)過程。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑穩(wěn)定性高

逆轉(zhuǎn)錄實驗要使用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物，避免引物交叉污染。北京快速逆轉(zhuǎn)錄試劑價格

逆轉(zhuǎn)錄實驗的準(zhǔn)備工作：1、實驗器具與材料：（1）移液頭：200ul、10ul；（2）吸頭：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、實驗器具的處理與準(zhǔn)備，塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準(zhǔn)備：（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1。5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆?。?）RT中所需要的各種試劑。北京快速逆轉(zhuǎn)錄試劑價格

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