反轉(zhuǎn)錄酶的選擇:反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscriptase)又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性,能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性,可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR,理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA的合成才能在較高的溫度下進(jìn)行,確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的RNA,并確保在整個反應(yīng)過程中的全部活性,從而得到質(zhì)量更高的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中避免光照,防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。北京快速逆轉(zhuǎn)錄試劑價格
RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項:去除基因組DNA污染:殘留的基因組DNA(gDNA)會對熒光定量結(jié)果造成很大的干擾,為了使結(jié)果更加的真實、可重復(fù),我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計時避免gDNA的擴(kuò)增,比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上;或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后,我們還有非常法寶,選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,一步到位去除gDNA,省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項:逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性:逆轉(zhuǎn)錄酶在整個反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外,逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要,在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,能夠減少RNA的二級結(jié)構(gòu),增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”,高于37℃時,穩(wěn)定性大幅下降。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑穩(wěn)定性高逆轉(zhuǎn)錄是許多病毒復(fù)制中必不可少的步驟。
逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)有重要的理論意義和實踐意義。(1)在致死病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了病基因,在人類一些病細(xì)胞如膀胱病、小細(xì)胞肺病等細(xì)胞中,也分離出與病毒病基因相同的堿基序列,稱為細(xì)胞病基因或原病基因。病基因的發(fā)現(xiàn)為疙瘩發(fā)病機(jī)理的研究提供了很有前途的線索。(2)在實際工作中有助于基因工程的實施。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備,可將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成DNA用以獲得目的基因。逆轉(zhuǎn)錄酶實驗操作注意事項:RNA提取一定要迅速,樣本要新鮮,組織盡量在液氮中研磨;RNA提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延,新提的RNA很容易降解;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程,需建立無RNAase環(huán)境,以避免模板RNA降解。RNase是RNA水解酶的統(tǒng)稱,包含RNaseA,RNaseH等,RNaseA可以水解單雙鏈RNA,RNaseH主要水解RNA與DNA雜交雙鏈中的RNA。
人體中也有逆轉(zhuǎn)錄過程,比如端粒的復(fù)制。端粒(telomere)是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由重復(fù)的DNA序列(TTAGGG)和核的蛋白組成,可以保護(hù)染色體末端,維持基因組完整性。端粒的末端是單鏈3'末端,形成一種緊湊的T環(huán)結(jié)構(gòu),可保持其穩(wěn)定性。其表面覆蓋著Shelterin復(fù)合物,包括TRF1(端粒重復(fù)結(jié)合因子1)、TRF2(端粒重復(fù)結(jié)合因子2)、TIN2(TRF1相互作用核的蛋白2)、RAP1(rif相關(guān)蛋白)、POT1(端粒保護(hù))和TPP1(端粒保護(hù)蛋白1)成功將人表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,對比觀察不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的差異特征,結(jié)果表明人胚胎、少兒、成人皮膚來源的表皮干細(xì)胞均有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度依次減弱。提示誘導(dǎo)和增強(qiáng)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)對維持表皮干細(xì)胞在體外自我更新和增殖能力可能具有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)的發(fā)展使RNA研究得到極大便利。
逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉(zhuǎn)錄酶的選擇,逆轉(zhuǎn)錄實驗前要對反應(yīng)體系進(jìn)行無RNA和無反轉(zhuǎn)錄酶的對照。多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性。①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性;以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性;由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。逆轉(zhuǎn)錄是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA的生物化學(xué)過程。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑穩(wěn)定性高
逆轉(zhuǎn)錄實驗要使用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物,避免引物交叉污染。北京快速逆轉(zhuǎn)錄試劑價格
逆轉(zhuǎn)錄實驗的準(zhǔn)備工作:1、實驗器具與材料:(1)移液頭:200ul、10ul;(2)吸頭:200ul、20ul;(3)EP管1。5ml、100ul;(4)水浴箱。2、實驗器具的處理與準(zhǔn)備,塑料制品:(包括吸頭、EP管等)將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中(必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水)37℃過夜,然后送至高壓3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小時左右烘干),試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準(zhǔn)備:(1)DEPC水:泡實驗器具的DEPC水的配制:1000ml雙蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的DEPC水的配制:100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水,加40ulDEPC,37℃過夜,送至高壓,后分裝到幾個1。5mlEP管中,-20℃中保存?zhèn)溆?。?)RT中所需要的各種試劑。北京快速逆轉(zhuǎn)錄試劑價格
蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司是一家集生產(chǎn)科研、加工、銷售為一體的****,公司成立于2016-10-20,位于張家港經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)(市高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)服務(wù)中心)F幢3樓。公司誠實守信,真誠為客戶提供服務(wù)。公司現(xiàn)在主要提供RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR等業(yè)務(wù),從業(yè)人員均有RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR行內(nèi)多年經(jīng)驗。公司員工技術(shù)嫻熟、責(zé)任心強(qiáng)。公司秉承客戶是上帝的原則,急客戶所急,想客戶所想,熱情服務(wù)。公司與行業(yè)上下游之間建立了長久親密的合作關(guān)系,確保RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR在技術(shù)上與行業(yè)內(nèi)保持同步。產(chǎn)品質(zhì)量按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研發(fā)生產(chǎn),絕不因價格而放棄質(zhì)量和聲譽(yù)。蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司依托多年來完善的服務(wù)經(jīng)驗、良好的服務(wù)隊伍、完善的服務(wù)網(wǎng)絡(luò)和強(qiáng)大的合作伙伴,目前已經(jīng)得到醫(yī)藥健康行業(yè)內(nèi)客戶認(rèn)可和支持,并贏得長期合作伙伴的信賴。