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M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比AMV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性,因此要獲得像AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中產(chǎn)生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA,要用8單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶才相當(dāng)于1單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制,該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉(zhuǎn)錄酶5X反應(yīng)緩沖液,也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液,因?yàn)檫@二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染,逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量,過少或質(zhì)量不佳將影響擴(kuò)增效果。高效的逆轉(zhuǎn)錄體系可提高反應(yīng)效率和檢測靈敏度。一步法逆轉(zhuǎn)錄制造商
RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):去除基因組DNA污染:殘留的基因組DNA(gDNA)會(huì)對熒光定量結(jié)果造成很大的干擾,為了使結(jié)果更加的真實(shí)、可重復(fù),我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)避免gDNA的擴(kuò)增,比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上;或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后,我們還有非常法寶,選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,一步到位去除gDNA,省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性:逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外,逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要,在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,能夠減少RNA的二級結(jié)構(gòu),增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”,高于37℃時(shí),穩(wěn)定性大幅下降。北京miQP2逆轉(zhuǎn)錄試劑企業(yè)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程中避免光照,防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。
反轉(zhuǎn)錄酶的選擇:反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscriptase)又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性,能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性,可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR,理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA的合成才能在較高的溫度下進(jìn)行,確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的RNA,并確保在整個(gè)反應(yīng)過程中的全部活性,從而得到質(zhì)量更高的cDNA。
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟:用SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT(20ul體積)1、準(zhǔn)備0、65ml的EP管。2、冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暫離心。3、65℃水浴5分鐘后,立刻0℃冰水浴至少1分鐘。4、短暫離心后,冰上操作:加入4ul5×First-StrandBuffer,1ul0.1MDTT,1ulRNAseInhibitor,1ulSSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶。5、短暫離心。6、50℃水浴60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。7、70℃水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。8、-20℃保存,或立即進(jìn)行PCR。MCERTmix含有比例優(yōu)化的Oligo(dT)和RandomPrimers,使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始,并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率,較大程度保證qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化,此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶,即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。
逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化,此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)。逆轉(zhuǎn)錄酶在生物界存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒以及真核細(xì)胞(如端粒酶)中,擬逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄酶,其DNA聚合酶帶有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。人類免疫缺陷病毒(HIV)就是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,含有逆轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中也有逆轉(zhuǎn)錄酶,例如端粒酶就是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,推測可能與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對所有器具和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面消毒和清潔,避免交叉污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑費(fèi)用
逆轉(zhuǎn)錄活性可以RNA為模板,合成與其序列互補(bǔ)的DNA鏈,生成DNA-RNA雜合雙鏈。一步法逆轉(zhuǎn)錄制造商
反轉(zhuǎn)錄酶的用處:由它催化轉(zhuǎn)錄合成的DNA稱為互補(bǔ)DNA(cDNA)。通常情況下,細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)由DNA到RNA的,所得RNA為信使RNA(mRNA)供蛋白質(zhì)合成作模板用。而在部分RNA病毒中,要實(shí)現(xiàn)自身擴(kuò)增,必須具有DNA,因此先由RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA再由cDNA轉(zhuǎn)錄出RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶可用RT—PCR,將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA后擴(kuò)增,以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶,并認(rèn)為此酶與病毒的致死性質(zhì)有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶也分布于某些正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質(zhì)非?;z傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究,已成為研究這些學(xué)科的有力工具。一步法逆轉(zhuǎn)錄制造商
蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司主營品牌有EZB,EZBioscience,EZMED,發(fā)展規(guī)模團(tuán)隊(duì)不斷壯大,該公司生產(chǎn)型的公司。是一家有限責(zé)任公司(自然)企業(yè),隨著市場的發(fā)展和生產(chǎn)的需求,與多家企業(yè)合作研究,在原有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上經(jīng)過不斷改進(jìn),追求新型,在強(qiáng)化內(nèi)部管理,完善結(jié)構(gòu)調(diào)整的同時(shí),良好的質(zhì)量、合理的價(jià)格、完善的服務(wù),在業(yè)界受到寬泛好評。公司擁有專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì),具有RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR等多項(xiàng)業(yè)務(wù)。英澤生物順應(yīng)時(shí)代發(fā)展和市場需求,通過**技術(shù),力圖保證高規(guī)格高質(zhì)量的RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR。