M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比AMV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性，因此要獲得像AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中產(chǎn)生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA，要用8單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶才相當(dāng)于1單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制，該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉(zhuǎn)錄酶5X反應(yīng)緩沖液，也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液，因?yàn)檫@二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量，過少或質(zhì)量不佳將影響擴(kuò)增效果。高效的逆轉(zhuǎn)錄體系可提高反應(yīng)效率和檢測靈敏度。一步法逆轉(zhuǎn)錄制造商

RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：去除基因組DNA污染：殘留的基因組DNA(gDNA)會(huì)對(duì)熒光定量結(jié)果造成很大的干擾，為了使結(jié)果更加的真實(shí)、可重復(fù)，我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)避免gDNA的擴(kuò)增，比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上；或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后，我們還有非常法寶，選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性：逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”，高于37℃時(shí)，穩(wěn)定性大幅下降。北京miQP2逆轉(zhuǎn)錄試劑企業(yè)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。

反轉(zhuǎn)錄酶的選擇：反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR，理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進(jìn)行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，并確保在整個(gè)反應(yīng)過程中的全部活性，從而得到質(zhì)量更高的cDNA。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟：用SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT（20ul體積）1、準(zhǔn)備0、65ml的EP管。2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暫離心。3、65℃水浴5分鐘后，立刻0℃冰水浴至少1分鐘。4、短暫離心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAseInhibitor，1ulSSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶。5、短暫離心。6、50℃水浴60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。7、70℃水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。8、－20℃保存，或立即進(jìn)行PCR。MCERTmix含有比例優(yōu)化的Oligo(dT)和RandomPrimers，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始，并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率，較大程度保證qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化，此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶，即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。

逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化，此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA（complementaryDNA,cDNA）。逆轉(zhuǎn)錄酶在生物界存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒以及真核細(xì)胞（如端粒酶）中，擬逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄酶，其DNA聚合酶帶有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。人類免疫缺陷病毒（HIV）就是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，含有逆轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中也有逆轉(zhuǎn)錄酶，例如端粒酶就是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，推測可能與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)所有器具和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面消毒和清潔，避免交叉污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑費(fèi)用

逆轉(zhuǎn)錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補(bǔ)的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。一步法逆轉(zhuǎn)錄制造商

反轉(zhuǎn)錄酶的用處：由它催化轉(zhuǎn)錄合成的DNA稱為互補(bǔ)DNA(cDNA)。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)由DNA到RNA的，所得RNA為信使RNA（mRNA）供蛋白質(zhì)合成作模板用。而在部分RNA病毒中，要實(shí)現(xiàn)自身擴(kuò)增，必須具有DNA，因此先由RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA再由cDNA轉(zhuǎn)錄出RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶可用RT—PCR，將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA后擴(kuò)增，以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，并認(rèn)為此酶與病毒的致死性質(zhì)有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶也分布于某些正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質(zhì)非?；z傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，已成為研究這些學(xué)科的有力工具。一步法逆轉(zhuǎn)錄制造商

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