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廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-05-12

逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶。RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下二種活性:依賴RNA的DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA的首先條鏈。依賴DNA的DNA聚合酶活性:以一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈DNA。在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí),建議選擇無(wú)RNaseH①活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性會(huì)與聚合酶活性競(jìng)爭(zhēng)RNA模板與DNA引物(或cDNA延伸鏈)形成的雜合鏈,并降解雜合鏈中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產(chǎn)量與長(zhǎng)度。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)避免RNA樣品的過(guò)凍、過(guò)熱處理,影響逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效果。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng),引物的選擇,OligodT:選擇OligodT時(shí),要求RNA必須有PolyA,所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT,所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高,較好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng),建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。特異性引物:特異性引物只能用你設(shè)計(jì)引物時(shí)的下游引物做RT,引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果,而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同,所以按照說(shuō)明書(shū)按照一個(gè)溫度做不是較佳選擇,一般不推薦。廣州彩色逆轉(zhuǎn)錄供貨商逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)要使用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物,避免引物交叉污染。

逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成與其互補(bǔ)的cDNA的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù),故逆轉(zhuǎn)錄稱為RT-PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)原理是,提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄PCR的出現(xiàn)使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí),使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):選擇合適的引物:隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的片段較小,很難得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的cDNA。單獨(dú)選擇某一種引物,實(shí)驗(yàn)可能都不完美,具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。

逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)一步法與兩步法具有以下區(qū)別:一步法比兩步法更快速、簡(jiǎn)便、減少了污染機(jī)會(huì)、減少了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、減少了PCR反應(yīng)的錯(cuò)配率;兩步法的優(yōu)勢(shì)在于中間產(chǎn)物cDNA,便于保存;且第二步PCR只取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的1/10進(jìn)行反應(yīng),有利于PCR條件的調(diào)整,實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性強(qiáng);兩步法可以在第二步PCR反應(yīng)體系中加入特異性引物,其靈敏度比一步法高;兩步法包括首先鏈cDNA合成和隨后的PCR反應(yīng),容易產(chǎn)生污染問(wèn)題;兩步法的實(shí)驗(yàn)預(yù)算要低于一步法。核酸合成與轉(zhuǎn)錄過(guò)程與遺傳信息的流動(dòng)方向相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng),在進(jìn)行RT反應(yīng)之前,應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面:RNA:成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA,高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA或SDS。在提取RNA的過(guò)程中,要特別防止RNase的污染,同時(shí)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應(yīng)中,在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入,因?yàn)閏DNA合成前的過(guò)程會(huì)使抑制劑變性,從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)Nase抑制劑只防止RNaseA,B,C對(duì)RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了這些抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常更換新手套。逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)常與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān),艾滋、乙肝等很多疾病也有逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。上海一體化反轉(zhuǎn)錄供貨商

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避免光照,防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商

逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程:生物體中的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程就比較復(fù)雜,比如逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)。病毒是真正的“極簡(jiǎn)風(fēng)”,所有東西都?jí)嚎s到非常。比如它的基因組中,經(jīng)常有些基因是重疊、嵌套結(jié)構(gòu),充分利用每一個(gè)堿基。所以它也不會(huì)專門(mén)編碼一個(gè)引發(fā)酶來(lái)合成引物,它一般是在組裝時(shí)帶走宿主的tRNA,在下次侵染時(shí)當(dāng)作引物使用。被用作引物的tRNA會(huì)結(jié)合在病毒基因組RNA鏈的中間,所以首先次只能合成出一部分cDNA,然后利用基因組RNA兩端的一段重復(fù)序列,“跳”回另一端,完成整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄。之后水解RNA鏈的時(shí)候,會(huì)留下一些片段作為復(fù)制的引物。雙鏈DNA的合成同樣也需要經(jīng)過(guò)一次跳躍(jump),以合成完整雙鏈。較后兩端具有相同的序列,稱為長(zhǎng)末端重復(fù)(longterminalrepeats,LTR)。LTR不只包含跳躍時(shí)用來(lái)配對(duì)的序列,還有整合信號(hào)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、polyA位點(diǎn)等重要結(jié)構(gòu)。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商

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