逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶。RT-PCR實驗中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下二種活性:依賴RNA的DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA的首先條鏈。依賴DNA的DNA聚合酶活性:以一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈DNA。在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時,建議選擇無RNaseH①活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性會與聚合酶活性競爭RNA模板與DNA引物(或cDNA延伸鏈)形成的雜合鏈,并降解雜合鏈中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產(chǎn)量與長度。逆轉(zhuǎn)錄實驗避免RNA樣品的過凍、過熱處理,影響逆轉(zhuǎn)錄反應的效果。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商
反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項,引物的選擇,OligodT:選擇OligodT時,要求RNA必須有PolyA,所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT,所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高,較好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應,建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。特異性引物:特異性引物只能用你設(shè)計引物時的下游引物做RT,引物設(shè)計質(zhì)量影響RT的結(jié)果,而且不同引物退火溫度本來就不相同,所以按照說明書按照一個溫度做不是較佳選擇,一般不推薦。廣州彩色逆轉(zhuǎn)錄供貨商逆轉(zhuǎn)錄實驗要使用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物,避免引物交叉污染。
逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成與其互補的cDNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)和cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)相結(jié)合的技術(shù),故逆轉(zhuǎn)錄稱為RT-PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗原理是,提取組織或細胞中的總RNA,以RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA鏈為模板進行PCR擴增,從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄PCR的出現(xiàn)使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項:選擇合適的引物:隨機引物法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的片段較小,很難得到全長轉(zhuǎn)錄本的cDNA。單獨選擇某一種引物,實驗可能都不完美,具體需要根據(jù)實驗目的來確定。
逆轉(zhuǎn)錄酶實驗一步法與兩步法具有以下區(qū)別:一步法比兩步法更快速、簡便、減少了污染機會、減少了RNA二級結(jié)構(gòu)、減少了PCR反應的錯配率;兩步法的優(yōu)勢在于中間產(chǎn)物cDNA,便于保存;且第二步PCR只取逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物的1/10進行反應,有利于PCR條件的調(diào)整,實驗重現(xiàn)性強;兩步法可以在第二步PCR反應體系中加入特異性引物,其靈敏度比一步法高;兩步法包括首先鏈cDNA合成和隨后的PCR反應,容易產(chǎn)生污染問題;兩步法的實驗預算要低于一步法。核酸合成與轉(zhuǎn)錄過程與遺傳信息的流動方向相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。
反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項,在進行RT反應之前,應考慮以下幾個方面:RNA:成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA,高質(zhì)量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中,要特別防止RNase的污染,同時在逆轉(zhuǎn)錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應中,在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性,從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑只防止RNaseA,B,C對RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了這些抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase,實驗過程中經(jīng)常更換新手套。逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)常與細胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān),艾滋、乙肝等很多疾病也有逆轉(zhuǎn)錄過程。上海一體化反轉(zhuǎn)錄供貨商
逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中避免光照,防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商
逆轉(zhuǎn)錄的過程:生物體中的逆轉(zhuǎn)錄過程就比較復雜,比如逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)。病毒是真正的“極簡風”,所有東西都壓縮到非常。比如它的基因組中,經(jīng)常有些基因是重疊、嵌套結(jié)構(gòu),充分利用每一個堿基。所以它也不會專門編碼一個引發(fā)酶來合成引物,它一般是在組裝時帶走宿主的tRNA,在下次侵染時當作引物使用。被用作引物的tRNA會結(jié)合在病毒基因組RNA鏈的中間,所以首先次只能合成出一部分cDNA,然后利用基因組RNA兩端的一段重復序列,“跳”回另一端,完成整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄。之后水解RNA鏈的時候,會留下一些片段作為復制的引物。雙鏈DNA的合成同樣也需要經(jīng)過一次跳躍(jump),以合成完整雙鏈。較后兩端具有相同的序列,稱為長末端重復(longterminalrepeats,LTR)。LTR不只包含跳躍時用來配對的序列,還有整合信號、啟動子、增強子、polyA位點等重要結(jié)構(gòu)。廣州莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商
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