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骨組織RNA提取之其它骨組織破碎方法:確保離心后液體全部濾過去,膜上沒有殘留,如有必要,可以加大離心力和離心時間。將基因組DNA清理柱子放在一個干凈2ml離心管內(nèi)(不用RNAsefree或者DEPC處理,一般干凈的新離心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干凈收集管),在基因組清理柱內(nèi)加500μl裂解液RLTPlus,13,000rpm離心30秒,收集濾液(RNA在濾液中),用微量移液器較精確估計濾過液體積(通常為450-500μl左右,濾過時候損失體積應(yīng)該減去),加入0.5倍體積的無水乙醇,此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。RNA提取可以用于研究不同類型的RNA,例如mRNA、rRNA或miRNA。泉州病毒RNA提取
DNA提取的幾種方法介紹,濃鹽法:利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同,將二者分離,常用的方法是用1M氯納提取化鈉抽提,得到的DNP黏液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間,而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。也可用0.15MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白。兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些。蘇州離心柱法DNA提取試劑研發(fā)DNA提取后可以用于PCR擴增、測序、基因編輯等多種應(yīng)用。
RNA提取和DNA提取實驗中常見問題及過程中的注意事項:低純度:如果提取的DNA被蛋白質(zhì)污染(低260/280),那么您可能開始時樣品過多,而蛋白質(zhì)沒有完全去除或溶解。如果DNA的260/230比率不佳,則問題通常是結(jié)合或洗滌緩沖液中的鹽分。確保使用較高質(zhì)量的乙醇來制備洗滌緩沖液,如果問題仍然存在,請再次洗滌色譜柱。與其他樣品相比,一些樣品含有更多的抑制劑。環(huán)境樣品特別容易出現(xiàn)純度問題,因為腐殖質(zhì)在提取過程中會被溶解。腐殖質(zhì)的行為與DNA相似,很難從硅膠柱中去除。
血漿DNA與血漿游離DNA提取試劑的選擇方法:血清血漿的量與DNA提取的核酸量成正比。因而,如果要提高核酸得率,可通過增加血清或血漿的量來實現(xiàn)。一般地,做血漿或血清核酸提取,樣本量較好在1ml以上。如果1ml或更大量樣本得不到滿意的檢測結(jié)果,則應(yīng)及時考慮更換提取試劑盒。操作簡便性也是血漿DNA提取試劑選擇的一個重要因素。操作過于復(fù)雜,不只費時費力,還容易導(dǎo)致樣本間的交叉污染,也容易損失樣本。特別是用于臨床檢測或樣本較多情況下的檢測,操作復(fù)雜如果導(dǎo)致交叉污染會引起誤診,還會影響出檢測報告的時間。因而,選用操作簡便、流暢的提取試劑盒非常重要。RNA提取可以使用不同的組織或細(xì)胞類型來比較RNA的表達(dá)。
RNA提取中常見的問題:OD260/OD280比值偏低:蛋白質(zhì)污染:確保不要吸入中間層及有機相。減少起始樣品量,確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻,并且離心分層的離心力和時間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,則用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。苯酚殘留:確保不要吸入中間層及有機相。加入氯仿后首先要充分混勻,并且離心分層的離心力和時間要足夠。多糖或多酚的殘留:一些特殊的組織和植物中,多糖、多酚含量較多,這些殘留也會導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此,從這類材料中提取RNA時,需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。設(shè)備限制:測定OD260及OD280數(shù)值時,要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性較好。用水稀釋樣品:測OD值時,對照及樣品稀釋液請使用10mMTris,pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。DNA提取的質(zhì)量可以通過測定純度、濃度和完整性來評估。病毒DNA提取制造商
DNA提取主要是CTAB方法,其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。泉州病毒RNA提取
血漿DNA與血漿游離DNA提取試劑的選擇方法:血漿DNA,又稱血液循環(huán)DNA、游離DNA,是指血液中游離于細(xì)胞外的DNA,其來源主要有三:白細(xì)胞崩解釋放的DNA、壞死組織特別是腫組織釋放入血液的DNA和染上病毒、細(xì)菌的DNA。近幾年來,隨著基因診斷技術(shù)的發(fā)展,游離DNA的應(yīng)用價值越來越大,如優(yōu)生篩查、腫早期診斷、遺傳病檢測和病原體染上基因檢測等。但血液中游離DNA含量一般較低,片段較小,不易提取,這很大程度影響了游離核酸的基因檢測和各種研究的開展。泉州病毒RNA提取
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