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對(duì)于外泌體的標(biāo)記和鑒定,獲得外泌體之后,如何對(duì)其進(jìn)行鑒定又是一個(gè)困擾研究者的問題。國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)(ISEV)在2014年提議,對(duì)于分離獲得的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定:WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)情況:外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)目缒さ鞍准易?CD63/CD81/CD9)、熱休克蛋白家族(HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90)和一些細(xì)胞特異性蛋白。其中CD63/TSG101是較常用到的外泌體標(biāo)志物。TEM鑒定外泌體形態(tài):電鏡具有較高的分辨率,可以直接觀察到樣品中外泌體的形態(tài)。NTA檢測(cè)外泌體粒徑及濃度:TEM可以觀察外泌體的形態(tài)學(xué)特征,但無法體現(xiàn)樣本中所有外泌體的粒徑分布情況及整體濃度。NTA(NanoparticleTrackingAnalysis)技術(shù)可快速準(zhǔn)確地分析外泌體的粒徑分布及濃度,為外泌體鑒定提供有力證據(jù)。外泌體可以作為一種新型的藥物輸送系統(tǒng),利用其高度選擇性的靶向性,有效地提高藥物的生物利用度。青島腦脊液外泌體蛋白檢測(cè)
外泌體的表征方法之光學(xué)方法:目前,光學(xué)方法是外泌體表征的主要方法,即動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、多角度光散射(MALS)和納米粒子跟蹤分析(NTA)。這些方法允許對(duì)尺寸(DLS0.5–200nm;MALS10–500nm;NTA10–1000nm)、尺寸分布和濃度進(jìn)行高分辨率測(cè)量。DLS和MALS的結(jié)合增加了測(cè)量范圍(0.5–500nm)和精度。光學(xué)方法比較受歡迎的,但缺點(diǎn)是靈敏度低、試劑消耗高以及需要昂貴的設(shè)備。在使用納米粒子跟蹤分析NTA方法過程中,熒光染料的加入也提高了分辨率,并允許通過使用熒光標(biāo)記來表征表面免疫表型。從而確定標(biāo)記物存在。青島腦脊液外泌體蛋白檢測(cè)外泌體可通過特定的組裝和功能修飾,提高其對(duì)宿主細(xì)胞的選擇性靶向性。
使用差速離心法分離外泌體主要需要注意的是轉(zhuǎn)子的選擇?!皵[動(dòng)桶”(SW)轉(zhuǎn)子和“定角”(FA)轉(zhuǎn)子,這些轉(zhuǎn)子的幾何形狀根本不同,因此沉降特性也不同。這些轉(zhuǎn)子之間的主要區(qū)別在于:FA轉(zhuǎn)子,與旋轉(zhuǎn)半徑相比,沉積顆粒的較大路徑長度通常較小,允許近似恒定遷移率并簡化描述。然而,第二個(gè)區(qū)別是圓形FA管的水平橫截面是橢圓形的,不同粒子的路徑長度根據(jù)軌跡與橢圓長軸的距離而不同。由于較短的路徑長度,外面顆粒可能沉降得更快,需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。
分離外泌體的方法之靜水過濾透析:它主要有助于將整個(gè)EV從高度稀釋的溶液中分離出來,而無需超速離心過程。280Musante等人展示了用于從尿液樣本中分離EV的HFD方案。在HFD的初始步驟中,用2000×g離心樣品以去除細(xì)胞,細(xì)菌和碎片作為沉淀。然后,將上清液保存在透析膜(1000kPa)中,1000kPa或更小的顆粒相應(yīng)地以靜水壓差通過膜。較后,通過離心將外泌體囊泡沉降40,000×g。在HFD分離過程中,外泌體級(jí)分在早期階段恢復(fù),與多步離心相比,這被認(rèn)為是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。與超速離心相比,HFD也被認(rèn)為是一種有效的方法。外泌體的分析需要根據(jù)不同來源的細(xì)胞選擇適宜的分離方法。
外泌體分離方法之親和層析分離法:在親和層析分離法方面,主要使用凝集素和合成Vn(venceremin)肽。凝集素將結(jié)合存在于外泌體表面的糖基化蛋白質(zhì),從而使外泌體沉淀。Vn肽分離技術(shù)基于其對(duì)含有HSP的細(xì)胞外顆粒的高親和力。然而,這種方法比較容易使提取物被膜表面上含有上述標(biāo)記物的細(xì)胞和其他顆粒污染。外泌體分離方法之介電泳分離法:介電泳分離法主要利用不同大小的粒子在不均勻電場中的位置差異。外泌體被吸引到高電區(qū)域,而較大的顆粒將位于低電區(qū)域。該方法速度快,適合用于高通量篩選,但缺點(diǎn)是需要加熱。外泌體可通過細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)移影響細(xì)胞的增殖、分化和生物學(xué)行為。青島腦脊液外泌體蛋白檢測(cè)
外泌體的轉(zhuǎn)移涉及細(xì)胞因子、基質(zhì)降解酶和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等多種調(diào)節(jié)步驟。青島腦脊液外泌體蛋白檢測(cè)
外泌體分離方法之免疫學(xué)分離方法:免疫學(xué)分離法是利用受位于外泌體膜中的選定蛋白質(zhì)標(biāo)記物影響的抗體對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記。這些標(biāo)記的外泌體可以進(jìn)一步輕松處理和純化,例如,使用微芯片或磁珠。磁分離后,外泌體被純化,磁珠被溶解和去除。通過這種簡單快速的方法,就可以獲得較高純度提取物,但不會(huì)分離出缺乏磁性標(biāo)記抗體識(shí)別的表面標(biāo)記的外泌體,這可能導(dǎo)致外泌體池表現(xiàn)效果不佳。這種方法雖然既省時(shí)又直接,輸出純度較高,但也需要較為昂貴的試劑。青島腦脊液外泌體蛋白檢測(cè)
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