逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)是以RNA為模板合成DNA的過程,即RNA指導下的DNA合成。此過程中,核酸合成與轉(zhuǎn)錄(DNA到RNA)過程與遺傳信息的流動方向(RNA到DNA)相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄嚴格意義上來說沒有什么區(qū)別,但是逆轉(zhuǎn)錄是某些病毒的自主行為,如逆轉(zhuǎn)錄病毒,它們在整合到宿主細胞內(nèi)前以RNA為模板形成DNA的過程;反轉(zhuǎn)錄是進行基因工程過程中,人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之為模板人工合成DNA的過程。二者雖同為RNA→DNA的過程,但地點不同,相對性的來說,逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi),反轉(zhuǎn)錄在體外。逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化,此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶,即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。彩色逆轉(zhuǎn)錄測序
逆轉(zhuǎn)錄時試劑沒混勻會怎么樣?會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象。RT-PCR的試劑都應在冰上融化,等完全融化后再?。挥眠^的試劑應瞬間離心后放回-20℃保存;試劑應按順序加,加完后再混勻離心。使用ReverTra-Ace、RNase-Inhibitor等酶類時,沒有混勻,會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象;由于酶保存液中含有50%的甘油,粘度高,分取時應慢慢吸取。miRNA的RT-PCR:1)引物稀釋:miRNARTPrimer儲存液濃度:10μM。miRNARTPrimer工作液濃度:2μM。RTPrimer工作液配置:5μLRT-primer儲存液+45μLDEPC水。miRNA前后引物的工作液(10μM)用儲存液(100μM)稀釋后分裝,放入-20℃冰箱保存,避免反復凍融。逆轉(zhuǎn)錄試劑蛋白檢測逆轉(zhuǎn)錄在研究RNA表達調(diào)控等領域有普遍的應用前景。
雖然莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術在分子生物學和醫(yī)學研究中具有普遍的應用,但在實際應用中還存在一些挑戰(zhàn)。例如,莖環(huán)結(jié)構的RNA分子需要經(jīng)過復雜的化學合成和純化過程,從而增加了技術的難度和成本。此外,莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術也面臨著樣品污染、PCR反應中的非特異擴增等問題,需要在實驗設計和數(shù)據(jù)分析中進行有效的控制和糾正??傊o環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術是一種重要的分子生物學技術,它具有特異性高、全長擴增、無需RNA純化等優(yōu)點,在RNA的研究和檢測中得到了普遍的應用。隨著分子生物學和醫(yī)學研究的不斷發(fā)展,莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術的應用范圍也會不斷擴展,并為科研和臨床診斷提供更多的技術支持。
逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化,此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA(complementaryDNA,cDNA)。逆轉(zhuǎn)錄酶在生物界存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒以及真核細胞(如端粒酶)中,擬逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有單獨的逆轉(zhuǎn)錄酶,其DNA聚合酶帶有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關。人類免疫缺陷病毒(HIV)就是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,含有逆轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有逆轉(zhuǎn)錄酶,例如端粒酶就是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,推測可能與細胞分化和胚胎發(fā)育有關。逆轉(zhuǎn)錄引物的設計需要考慮反向引物的特性。
多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,DNA指導的DNA聚合酶活性;以反轉(zhuǎn)錄合成的首先條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子。除此之外,有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性,這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術起了很大的推動作用,目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成出互補的DNA(cDNA),由此可構建出cDNA文庫(cDNalibrary),從中篩選特異的目的基因,這是在基因工程技術中較常用的獲得目的基因的方法。逆轉(zhuǎn)錄實驗過程需適當?shù)腞NA質(zhì)量,過少或質(zhì)量不佳將影響擴增效果。彩色逆轉(zhuǎn)錄測序
逆轉(zhuǎn)錄PCR反應過程中要注意反應管中溶液面積不宜過高,避免泡沫問題。彩色逆轉(zhuǎn)錄測序
RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄引物設計原則:1.上下游引物要保守:擴增子長度需選擇一段保守片段(100-200bp)進行PCR擴增,選擇片段需跨越內(nèi)含子,因內(nèi)含子的基因組DNA序列不會被擴增,也可減少從污染的基因組DNA中擴增得到的假陽性風險。引物選取同樣需要保守。2.引物長度和Tm值:引物設計長度為18-25bp,Tm值在50-65℃之間,引物中GC含量在40-60%。設計引物時盡量避免出現(xiàn)4個或超過4個G堿基。RT-PCR實驗陰性對照:反轉(zhuǎn)錄陰性對照應包括在所有的RT-PCR的實驗中,用來檢測DNA是否污染(如基因組DNA或PCR產(chǎn)物)。該對照所指不加反轉(zhuǎn)錄酶,通過反轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA在進行熒光定量PCR檢測。如檢測到擴增,則樣本中可能含有基因組DNA污染。彩色逆轉(zhuǎn)錄測序
英澤生物,2016-10-20正式啟動,成立了RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR等幾大市場布局,應對行業(yè)變化,順應市場趨勢發(fā)展,在創(chuàng)新中尋求突破,進而提升EZB,EZBioscience,EZMED的市場競爭力,把握市場機遇,推動醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)的進步。業(yè)務涵蓋了RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR等諸多領域,尤其RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR中具有強勁優(yōu)勢,完成了一大批具特色和時代特征的醫(yī)藥健康項目;同時在設計原創(chuàng)、科技創(chuàng)新、標準規(guī)范等方面推動行業(yè)發(fā)展。隨著我們的業(yè)務不斷擴展,從RNA\DNA試劑盒,外泌體提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR等到眾多其他領域,已經(jīng)逐步成長為一個獨特,且具有活力與創(chuàng)新的企業(yè)。值得一提的是,英澤生物致力于為用戶帶去更為定向、專業(yè)的醫(yī)藥健康一體化解決方案,在有效降低用戶成本的同時,更能憑借科學的技術讓用戶極大限度地挖掘EZB,EZBioscience,EZMED的應用潛能。