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逆轉(zhuǎn)錄是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象,它在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。逆轉(zhuǎn)錄是指將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的過程,與正常的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過程相反。這個過程由逆轉(zhuǎn)錄酶來完成,而逆轉(zhuǎn)錄酶是一種酶類蛋白質(zhì),普遍存在于病毒和一些細胞中。逆轉(zhuǎn)錄的重要性在于它是某些病毒的復(fù)制過程中必不可少的一步。許多病毒的遺傳物質(zhì)是RNA分子,而它們必須先將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA,才能利用細胞的合成機制來進行復(fù)制。這種轉(zhuǎn)錄過程一旦完成,病毒的DNA就可以與宿主細胞的DNA結(jié)合在一起,從而使病毒的遺傳物質(zhì)被復(fù)制并傳遞下去。逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中要使用干燥無菌的管頭和標(biāo)本采集器避免受外界污染。蘇州一步法逆轉(zhuǎn)錄酶穩(wěn)定性高
M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比AMV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性,因此要獲得像AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中產(chǎn)生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA,要用8單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶才相當(dāng)于1單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制,該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉(zhuǎn)錄酶5X反應(yīng)緩沖液,也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液,因為這二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉(zhuǎn)錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染,逆轉(zhuǎn)錄實驗過程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量,過少或質(zhì)量不佳將影響擴增效果。一體化逆轉(zhuǎn)錄多少錢逆轉(zhuǎn)錄酶通常具有多種活性,如逆轉(zhuǎn)錄活性、復(fù)制活性與RNA酶H活性。
逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶。RT-PCR實驗中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下二種活性:依賴RNA的DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA的首先條鏈。依賴DNA的DNA聚合酶活性:以一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈DNA。在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時,建議選擇無RNaseH①活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性會與聚合酶活性競爭RNA模板與DNA引物(或cDNA延伸鏈)形成的雜合鏈,并降解雜合鏈中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產(chǎn)量與長度。
莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄是一種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的技術(shù),它利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子作為反向引物,在逆轉(zhuǎn)錄過程中特異性地擴增目標(biāo)RNA分子。該技術(shù)在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中得到了普遍的應(yīng)用,特別是在RNA的研究和檢測中具有獨特的優(yōu)勢。莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)的基本原理是利用逆轉(zhuǎn)錄酶和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA作為反向引物,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并在PCR反應(yīng)中擴增。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子具有較高的穩(wěn)定性和特異性,可以特異性地識別和結(jié)合目標(biāo)RNA分子,從而在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中作為反向引物擴增目標(biāo)cDNA。此外,由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子與目標(biāo)RNA分子的堿基序列互補,因此莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以避免隨機引物引起的非特異擴增。質(zhì)粒RNA檢測中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要特定反應(yīng)體系。
逆轉(zhuǎn)錄常見問題及解決方法之RNA濃度不高:a)、原始組織樣本或細胞量太少:提高加入量。b)、RNA發(fā)生降解:如果使用者確定提取RNA的試劑/器具沒有問題,RNA的降解通常發(fā)生在樣品破碎/勻漿階段。有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源RNase活性:1.立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。這只適合培養(yǎng)細胞及內(nèi)源RNase含量較低的并且較容易勻漿的組織,2.對于內(nèi)源RNase含量高或不易勻漿的組織,如肝臟、胰腺、脾臟、肌肉等,或植物組織,需要切成小塊后立即投入液氮冷凍,再按說明進行破碎/勻漿。c)、加入異丙醇后室溫沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可,無需過夜沉淀。逆轉(zhuǎn)錄實驗相關(guān)關(guān)器材如逆轉(zhuǎn)錄儀需經(jīng)常檢查,以保證反應(yīng)可靠性。一體化逆轉(zhuǎn)錄多少錢
逆轉(zhuǎn)錄是許多病毒復(fù)制中必不可少的步驟。蘇州一步法逆轉(zhuǎn)錄酶穩(wěn)定性高
大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性;以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為賴氨酸的tRNA,在引物tRNA3'-末端以5'→3'方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3'→5'外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性;由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNaseH從RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性;以反轉(zhuǎn)錄合成的首先條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子。蘇州一步法逆轉(zhuǎn)錄酶穩(wěn)定性高
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