磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實操過程中有哪些注意事項？細(xì)節(jié)決定成敗，在科研中更是如此。1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會很淺，結(jié)果也不可信。2.加一抗后比較好4度過夜，保證抗體有充分的結(jié)合時間。因為磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分。二抗則室溫1小時即可。3.磷酸化抗體的好壞是一個關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。務(wù)必找專業(yè)的磷酸化抗體公司訂購。4.比較好根據(jù)廠商的protocol來操作實驗，這是實驗成功的保證。5.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會有不同要求。瑞普信生物技術(shù)有限公司專業(yè)的第三方檢測Western Blot。自貢慢病毒包裝第三方檢測方法

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    每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層。在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產(chǎn)生。④接上正負(fù)極，按膜向正極的方向?qū)⑥D(zhuǎn)移盒放入電轉(zhuǎn)儀中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液。⑤將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中，100V恒壓轉(zhuǎn)膜1h。⑥轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出PVDF膜，放入5BSA室溫封閉2h。⑦取出膜，于搖床上用TBST洗膜5min3次。⑧孵育袋中加入TBST稀釋的一抗（1500）4℃孵育過夜。⑨TBST洗膜5min3次，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（13000），室溫孵育1h。⑩TBST洗膜10min3次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)至暗處出現(xiàn)亮條帶，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。三、實驗結(jié)果蛋白DH。時間就是金錢，效率就是生命唯有惜時才能成功，唯有努力方可成就。

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