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    3充分裂解后。12000rpm離心5min，取上清。4取部分上清蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按如下步驟①按試劑盒說明書將A液和B液以501的比例配制成工作液；②取2000μg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，用PBSpH2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL共9時(shí)間就是金錢，效率就是生命唯有惜時(shí)才能成功，唯有努力方可成就個(gè)濃度梯度；③取上清液10μL，用PBS稀釋20倍；④每管中加20μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的上清液，再加上述工作液，37℃孵育30min，562nm處測吸光度，記錄OD值；⑤根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及相應(yīng)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線yy00..00000077xx00..11553322RR2200..0..4400..8811..2211..000000濃濃度度uugg//mmLLOODD值值各各濃濃度度標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品品線線性性各各濃濃度度標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品總蛋白濃度（mg/mL）樣品.OD值mg/、Western-Blot檢測總蛋白中目的蛋白表達(dá)。1灌膠①蒸餾水清洗灌膠玻璃板，豎直晾干。②配制13％分離膠10mL，加TEMED10μL、10％過硫酸銨100μL，混勻后立即灌膠，灌至齒梳下緣2～3mm（事先做好標(biāo)記），用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣，室溫靜置45min待膠完全聚合。

WB（Westernblot），即蛋白印跡或免疫印跡（immunoblotting），是一項(xiàng)在分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣的技術(shù)。這一技術(shù)利用抗體與組織或細(xì)胞樣品中特定蛋白的特異性結(jié)合作用，根據(jù)顯色條帶的位置和強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)蛋白鑒定和表達(dá)分析。WB技術(shù)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性。選用合適的內(nèi)參抗體能夠校正蛋白定量和上樣過程中的誤差，通過灰度計(jì)量可以定性或定量分析不同樣品中蛋白表達(dá)情況。做第三方檢測時(shí)為什么有時(shí)候條帶會出現(xiàn)拖帶或者彎曲？在使用特定裂解緩沖液時(shí)，或者一些植物或脂肪含量高的樣品中成分較復(fù)雜，會對電泳條帶產(chǎn)生干擾；樣品變性不徹底、有降解發(fā)生、修飾、上樣過大等情況會導(dǎo)致拖帶，凝膠不均勻、電泳裝置滲漏、電壓/電流過大、膠孔不平等原因會導(dǎo)致條帶彎曲，當(dāng)很小分子量的蛋白電泳到接近凝膠下沿時(shí)也會出現(xiàn)條帶扭曲。成都瑞普信生物技術(shù)有限公司第三方檢測實(shí)驗(yàn)專業(yè)嗎？

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磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實(shí)操過程中有哪些注意事項(xiàng)？細(xì)節(jié)決定成敗，在科研中更是如此。1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會很淺，結(jié)果也不可信。2.加一抗后比較好4度過夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。因?yàn)榱姿峄牡鞍字徽伎偟牡鞍琢康臉O少部分。二抗則室溫1小時(shí)即可。3.磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。務(wù)必找專業(yè)的磷酸化抗體公司訂購。4.比較好根據(jù)廠商的protocol來操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。5.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會有不同要求。ELISA法第三方檢測機(jī)構(gòu)

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