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西藏免疫熒光雙染第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2022-09-03

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“做miRNA下調(diào),QPCR檢測(cè)miRNA,表達(dá)水平無(wú)變化”,這到底是怎么回事?現(xiàn)有miRNA抑制手段,無(wú)論是基于載體構(gòu)建的、還是化學(xué)合成的,本質(zhì)上都是用跟成熟體互補(bǔ)的反義miRNA(miRNA海綿體屬于不完全互補(bǔ)的反義RNA重復(fù)),其可以通過(guò)結(jié)合miRNA,阻斷其與靶基因結(jié)合,但并不能有效引發(fā)miRNA的降解,原因有兩方面:其一是反義RNA與miRNA結(jié)合后,序列很短,導(dǎo)致Dicer酶(細(xì)胞內(nèi)降解雙鏈RNA的主角)不能有效結(jié)合;其二是miRNA與Ago2以RISC復(fù)合物的形式存在,該復(fù)合物也會(huì)導(dǎo)致Dicer酶無(wú)法高效結(jié)合。因此,如果以反義RNA技術(shù)抑制miRNA功能,QPCR可以做,如果檢測(cè)出表達(dá)水平下降還好,即便未檢測(cè)到,也不表示抑制無(wú)效,正確的做法是直接檢測(cè)目的基因蛋白水平是否有上調(diào)。但若實(shí)驗(yàn)者不清楚靶基因的情況下,不檢測(cè)到miRNA下調(diào),心里是沒(méi)底的。

磷酸化蛋白的WB第三方檢測(cè)在實(shí)操過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)?細(xì)節(jié)決定成敗,在科研中更是如此。1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑,還要加入一定量的磷酸酶抑制劑,否則即使band壓出來(lái)也會(huì)很淺,結(jié)果也不可信。2.加一抗后比較好4度過(guò)夜,保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。因?yàn)榱姿峄牡鞍字徽伎偟牡鞍琢康臉O少部分。二抗則室溫1小時(shí)即可。3.磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素,所以要選擇好的廠商。務(wù)必找專(zhuān)業(yè)的磷酸化抗體公司訂購(gòu)。4.比較好根據(jù)廠商的protocol來(lái)操作實(shí)驗(yàn),這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。5.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會(huì)有不同要求。第三方檢測(cè)細(xì)胞整體實(shí)驗(yàn)就找成都瑞普信!

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