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廣東anti-Flag COIP免疫磁珠批量定制

來源: 發(fā)布時間:2022-01-29

免疫共沉淀(COIP)優(yōu)點

(1)相互作用的蛋白質都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);

(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的,可以避免人為的影響;

(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。

免疫共沉淀(COIP)缺點

(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;

(2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;

(3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇***檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

(4)靈敏度沒有親和色譜高。 BEENbio Anti Flag Co-IP&CHIP磁珠廠家直銷。廣東anti-Flag COIP免疫磁珠批量定制

免疫磁珠法(MACS):免疫磁珠法是2O世紀80年代出現(xiàn)的技術方法。1983年Ugelstad提出將免疫磁珠用于細胞分選,1990年,Mihenyi建立了MACS。這一方法的**是在磁珠表面包被具免疫反應性的抗體進行抗原抗體反應,在細胞表面形成玫瑰花結,這些結合了磁珠的細胞一旦置于強大的磁場下,就會與其他未被結合的細胞分群,具***順磁場的磁珠脫離磁場后立即消失磁性,這樣就可以篩選或去除所標記的細胞,從而達到陽性或陰性選擇細胞的目的。這一技術已經(jīng)***運用于細胞及分子生物學,分離基因、靶細胞及造血干細胞等。其分離效果得到了免疫熒光、PCR、FISH及FACS等方法的確認。免疫磁珠可以有效地分選細胞,從而決定了這一方法在神經(jīng)干細胞分選中應用的技術可行性。黑龍江anti-Myc COIP免疫磁珠代理價格4折起納米免疫磁珠富集單核增生李斯特菌的研究。

COIP 磁珠緩沖液匯總

細胞裂解液
正常RIPA 細胞裂解緩沖液(一般是公司購買)
結合緩沖液binding buffer
用RIPA 細胞裂解緩沖液代替
洗滌緩沖液Washing buffer
PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)
洗脫緩沖液Elution buffer
直接加入1*蛋白loading buffer, 98oC 5 min后棄去磁珠后,收集上清液檢測。

COIP 常見問題及對策


常見問題
原因
解決方法
高的背景條帶
蛋白非特異結合到抗體,磁珠或EP管上洗滌次數(shù)不夠
對裂解液進行預處理去除非特異蛋白; 在***一次洗滌前, 轉移整個樣品到新的EP管中然后進行離心。
洗滌次數(shù)不夠
增加洗滌的時間和次數(shù)。
無蛋白條帶
Myc 標簽蛋白沒有表達
確保目的蛋白帶有Flag/HA/Myc 標簽; 制備新鮮的裂解液; 使用恰當?shù)牡鞍酌敢种苿?/span>
孵育時間不足
增加孵育時間。
樣品中存在干擾物質
裂解液中存在高濃度的DTT,2-mercaptoetMyc nol或者其他的還原劑;

利用免疫磁珠從SD大鼠坐骨神經(jīng)分離培養(yǎng)獲得大量,高純度雪旺細胞的方法.[方法]選用4-7dSD大鼠,無菌條件下取雙側坐骨神經(jīng),解剖鏡下剝離去除神經(jīng)外膜,獲得神經(jīng)束,將神經(jīng)束剪碎至1mm3大小.采用雙酶2次消化法消化,胎牛血清中止消化后,離心并加入DF12培養(yǎng)液培養(yǎng).7d后應用免疫磁珠法對細胞進行純化培養(yǎng),培養(yǎng)2d后進行傳代接種.培養(yǎng)過程中對細胞進行形態(tài)學觀察,計數(shù)及活力測定;MTY法繪制細胞生長曲線,采用免疫細胞化學熒光染色對細胞進行鑒定并且計算所得細胞純度.[結果]分離培養(yǎng)所得細胞即為雪旺細胞;采用免疫磁珠法能對培養(yǎng)所得雪旺細胞進行純化.純化后雪旺細胞活力為96%±0.5%,純度98%±1.1%,培養(yǎng)2d后就可以傳代.[結論]免疫磁珠法可以用于雪旺細胞的純化培養(yǎng),所得雪旺細胞純度高,活力強,能滿足組織工程人工神經(jīng)的需要.BEENbio ProteinA/G Co-IP&CHIP磁珠廠家直銷。

COIP實驗步驟
第三步:免疫共沉淀
根據(jù)不同的抗體結合方式,這里的免疫共沉淀步驟會稍有不同,但是本質是一樣的,都是為了形成抗原-蛋白復合物。
如果直接使用 Protein A/G 結合的 beads,先進行細胞裂解液/蛋白混合物與抗體的孵育,再加入 beads 將蛋白-抗體復合物拉下來。
如果使用了交聯(lián)劑將抗體與 Protein A/G 固定,或者直接將抗體固定在 beads,則將固定抗體的 beads 與細胞裂解液或則蛋白混合物一起孵育。
增加在洗脫之前的洗滌次數(shù)或在免疫共沉淀緩沖液中加入 Triton X-100 ,可以降低非特異性結合,以防止蛋白在陰性對照樹脂實驗樣品中被檢測到。
第四步:洗脫與檢測
***一步則是使用洗脫緩沖液將互作蛋白復合物洗脫,并通過 Western Blot 或者 Mass spectra 檢測鑒定蛋白。當?shù)鞍谆蚩贵w對低 pH 的緩沖液敏感,可使用中性 pH 值的洗脫緩沖液。
注意事項:
如后續(xù)需進行酶活或功能性分析,則需使用兼容下游檢測的 Elution buffer 進行洗脫。
對于交聯(lián)劑結合的 beads,為了保持抗體偶聯(lián)樹脂的活性,應立即再生和存儲樹脂,保證抗體可以重復利用。
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免疫磁珠法富集循環(huán)腫瘤細胞研究進展。廣東anti-Flag COIP免疫磁珠批量定制

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標簽: 免疫磁珠